甲基化PCR檢測服務 天津賽爾生物

                            甲基化PCR檢測服務 
     甲基作為一個化學基團，能結(jié)合在ＤＮＡ鏈上的某些特定部位，這個過程叫甲基化。相反，甲基從ＤＮＡ鏈上脫落的過程就叫做去甲基化，DNA甲基化是與基因表達的沉默相關的一種表觀遺傳修飾。 Daniel Tenen等提出，活性轉(zhuǎn)錄直接調(diào)控DNA甲基化的水平。 
  
   
天津賽爾生物提供甲基化PCR檢測服務：
160-200元/反應/基因（不包括引物合成的費用）
超過10個反應，引物合成可以優(yōu)惠。
客戶需提供相關文獻和模板.

                        甲基化PCR檢測方法
一、基因組DNA的提取
重點在于DNA的純度，即減少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取過程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除兩者。
使用兩者的細節(jié)：
1.  蛋白酶K可以使用滅菌雙蒸水配制成20 mg/ml；
2.  RNA酶必須要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在購買市售RNA酶后進行再處理，配制成10 mg/ml。否則可能的后果是不僅沒有RNA，連DNA也被消化了。兩者均于-20℃保存。
3.  驗證提取DNA的純度的方法有二：
（1）紫外分光光度計計算OD比值；
（2）1%-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
二、亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA 
如不特別指出，所用雙蒸水（DDW）均經(jīng)高壓蒸汽滅菌。
1.  將約2 ug DNA于1.5 ml EP管中使用DDW稀釋至50 ul；
2.  加5.5 ul 新鮮配制的3 M NaOH； 
3.  42℃水浴30 min；
水浴期間配制：
4.  10 mM 對苯二酚（氫醌），加30 ul至上述水浴后混合液中；（溶液變成淡黃色）
5.  3.6 M 亞硫酸氫鈉（Sigma，S9000），配制方法：1.88 g 亞硫酸氫鈉使用DDW稀釋，并以3 M NaOH滴定溶液至pH 5.0，最終體積為5 ml。這么大濃度的亞硫酸氫鈉很難溶，但加入NaOH后會慢慢溶解，需要有耐心。pH一定要準確為5.0。加520 ul 至上述水浴后溶液中。
6.  EP管外裹以鋁箔紙，避光，輕柔顛倒混勻溶液。 
7.  加200 ul 石蠟油，防止水分蒸發(fā)，限制氧化。
8.  50℃避光水浴16 h。
一般此步在4 pm開始做，熟練的話不到5 pm即可完成，水浴16 h正好至次日8 am以后收，時間上很合適。
注意事項：
（1）基因組DNA的量不需十分精確，寧多勿少，因為在以后純化回收步驟中會有丟失，且此方法修飾最多可至4ug。
（2）所有試劑均須新鮮配制，所以配液的技術要過關，既要快，又要精確。
（3）亞硫酸氫鈉溶液呈強酸性，一定用堿將PH調(diào)制5.0，否則PH不合適會影響后續(xù)純化吸收。
（4）水浴最好達16小時，雖可以短至8小時，但后者修飾會有不完全。
三、修飾后DNA純化回收
EP管如無特別說明均為高壓蒸汽滅菌的。
1.  將移液器槍頭伸入石蠟油層下，先輕輕加壓使其中一小段石蠟油排出，然后吸取混合液至一潔凈1.5ml EP管中。
2.  以下使用Promega Wizard Cleanup DNA純化回收系統(tǒng)（Promega，A7280）
（1）70℃水浴預熱DDW；配制80%異丙醇；
（2）加1 ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin，輕柔顛倒混勻，使DNA充分與樹脂結(jié)合；
（3）由于該試劑盒中僅配備針筒沒有針栓，如果有真空負壓吸引器，使用起來很方便；如果沒有，需要自備3 ml~5 ml 注射器。將注射器針筒與試劑盒提供的回收小柱緊密連接后，將上述混合物用移液器移至針筒內(nèi)，用2 ml 以上的EP管放置小柱下接收廢液。加針栓，輕輕加壓，將液體擠出，此時可見小柱內(nèi)有白色的樹脂沉積。
（4）將注射器與小柱分離后拔出針栓，再將針筒與小柱連接，向針筒內(nèi)加入2 ml 80%的異丙醇，插入針栓，輕輕加壓，將異丙醇擠出。此為洗滌步驟。
（5）將注射器與小柱分離，將小柱置于潔凈1.5 ml 潔凈EP管上，離心12 000 rpm，2 min，以甩去殘余異丙醇成分，使樹脂干燥。此時，修飾后DNA處于與樹脂結(jié)合狀態(tài)。
（6）將小柱取下置于另一潔凈1.5 ml EP管上，移液器加50 ul 預熱好的DDW，室溫放置5 min。
（7）離心12 000 rpm，20 s，此為洗脫步驟，此時EP管內(nèi)液體即為洗脫的修飾后DNA溶液，終體積為50 ul。
3.  加5.5 ul 新鮮配制的3 M NaOH，室溫放置15 min。
4.  加33 ul 10 M乙酸銨，以中和NaOH，使溶液pH于7.0左右。
5.  加4 ul 10 mg/ml 糖原，此作為沉淀指示劑，因為其與乙醇混合后可產(chǎn)生沉淀，便于以后離心后辨別回收物的位置，以防在吸取殘余乙醇時將回收物吸走。其實，加入這些糖原究竟能起多大作用，不好說。不過有國產(chǎn)糖原賣，包裝不大，也很便宜，買來一用，算嚴格遵守文獻的步驟吧。
6.  加270 ul 冰無水乙醇，置于-20度，過夜沉淀。有人為沉淀最短可至2小時，但我認為時間長些可能會更好。并且做到此步驟時，一般會到中午，如果樣本多的話要到下午，不妨放置過夜，日程可以輕松些，順便做些其他試驗。如果想當天做完，沒有問題，但我認為最好多沉淀些時候，至少6小時吧。
7.  4度，12 000 rpm 離心，30 min，倒去上清液，收集沉淀。不必吸凈。
8.  加500 ul 70%乙醇，不要將沉淀吹打起來，只要把乙醇加上即可。輕柔傾斜EP管，旋轉(zhuǎn)一圈，再次離心，4度12 000 rpm，5 min。離心后倒掉上清，再加同量乙醇，同樣再做一遍。此為洗滌步驟，共2次。
9.  倒掉上清，并常溫簡短離心后，將附壁乙醇離至EP管底，移液器小心將殘余液體吸凈，室溫干燥5 min，或沉淀由不透明變?yōu)榘胪该骰蛲该鲿r，加入20 ul~30 ul DDW，溶解沉淀。至此，已完成了修飾后DNA的純化回收，所得為修飾后DNA溶液，可用于此后的進一步實驗。
10.  -20℃保存DNA溶液。
注意事項：
（1）在使用注射器時，一定要用力均勻且輕，如使用暴力，會將小柱內(nèi)的薄膜擠破，失去作用。
（2）乙酸銨、糖原不需新鮮配制，糖原配好后放在-20度保存，乙酸銨室溫即可，因為這樣濃度的乙酸銨非常難溶，一旦放在4度，取出用時也會有很多溶質(zhì)析出。
（3）異丙醇、70%乙醇都不需要新鮮配制，但如果用量大，現(xiàn)場配也很方便。
此步關鍵是在樹脂與DNA的結(jié)合上，這就再次強調(diào)第二部分調(diào)亞硫酸鈉PH值得重要性。因為樹脂與DNA結(jié)合需要有一個適當?shù)膒H，如前一步?jīng)]做好，此步樹脂不能與DNA很好結(jié)合，將會帶來災難性后果，即DNA隨著液體被擠出了，洗脫時實際已沒有任何DNA了。


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