氨基酸組成分析

——即蛋白質藥物的氨基酸組成分析技術服務

蛋白質藥物的氨基酸組成分析是應用高效液相色譜法對經過水解的蛋白質所得氨基酸進行高效、靈敏、快速的定量分析。蛋白質在6 mol HCL中真空狀態(tài)下經過110℃/24h水解完全形成游離氨基酸，再通過異硫氰酸苯酯（PITC）對所得氨基酸衍生化，用高效液相色譜對所得的衍生產物進行梯度洗脫，使得不同氨基酸衍生物分離開來，通過外標法對每個氨基酸衍生物的含量進行測定，進而得知蛋白質樣品中氨基酸的含量信息。

“氨基酸組成分析是蛋白質類藥物臨床前理化性質分析的必做項目之一”

技術指標

●  樣品要求：

供試品為多肽蛋白固體樣品，總量應不少于4mg，干燥未潮解；

供試品為多肽蛋白液體樣品，濃度應不低于1mg/ml，多肽蛋白總量應不少于4mg，且透明澄清、無混濁、無沉淀。

●  設備特性和色譜參數(shù)：

HPLC儀器：高效液相色譜儀（SHIMADZU，HPLC LC-20A）；

色譜柱：氨基酸分析柱（Dikma，Diamonsil AAA（5u 250mm×4.6mm））；

檢測器：紫外檢測器；檢測波長：254nm；流速：1ml/min；

相關液相梯度如下：0-39分鐘，B液線性梯度從5%-48%；39-40分鐘，B液線性梯度從48%-100%；40-45分鐘，B液維持在100%。

異硫氰酸苯酯（PITC）衍生法原理示意圖

氨基酸標準品進行PTIC分析的HPLC圖譜

案例分析

●  蛋白質類供試品的氨基酸組成分析

流速：1ml/min；檢測波長254nm；柱溫：30℃。

A液為50mM乙酸鈉水溶液（pH 6.5）；B液為 甲醇:乙腈:水=2:6:2混合溶液。

洗脫梯度：

結果：

蛋白質類供試品進行PTIC法測定氨基酸組成的HPLC圖譜

Q&A

1)異硫氰酸苯酯（PITC）衍生法在氨基酸組成中的應用？

大多數(shù)氨基酸無紫外吸收和熒光發(fā)射特性，標準折射探測儀對氨基酸檢測也無足夠的靈敏度。為提高分析檢測靈敏度和分離選擇特性，通常將氨基酸衍生，衍生方式有柱前衍生和柱后衍生兩種。柱前衍生法常用的有：鄰苯二甲醛（OPA）法、丹磺酰氯（DANSYL-Cl）法、磺酰氯二甲胺偶氮（DABSYL-Cl）法、氯甲酸芴甲酯（FMOC- Cl）法、異硫氰酸苯酯（PITC）法等；柱后衍生法常用的有：茚三酮法、鄰苯二甲醛（OPA）法、熒光胺法等。其中柱前衍生法中異硫氰酸苯酯（PITC）法以其衍生方便快速，衍生物單一穩(wěn)定，分析時間短，結果準確，試劑、副產物、溶劑等多種干擾因素可通過快速蒸發(fā)去除，紫外檢測（254nm）靈敏度高、可達1pmol，一、二級氨基酸均可檢測等優(yōu)點，成為蛋白質組成分析的重要手段。

2)氨基酸組成分析中的定量分析方法介紹。

現(xiàn)代分離提純技術的發(fā)展使蛋白質操作微量化，但也給定量帶來了困難，一般很難通過常規(guī)的稱量或測試蛋白質溶液在280nm的光吸收值來準確定量蛋白質，所以將蛋白質水解成游離的氨基酸，對氨基酸進行定量從而來推算蛋白質的含量成為較可靠的方法。按照中國藥典對蛋白質藥測試的規(guī)定，氨基酸組成分析的相對定量已經能夠滿足檢測要求，對蛋白質類藥物進行相應的質控和結構的分析，以及樣品是否為蛋白質的鑒別。