二硫鍵檢測

——即蛋白質(zhì)藥物的二硫鍵配對分析技術(shù)服務(wù)

二硫鍵是重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾形式，也是一種比較特殊的修飾。蛋白質(zhì)通過各種鏈間和鏈內(nèi)的半胱氨酸連接在一起，對蛋白質(zhì)分子保持正確的高級結(jié)構(gòu)，維持必要的生物活性至關(guān)重要。因此在蛋白質(zhì)類藥物的生物化學(xué)分析中，二硫鍵一直是關(guān)心的重點。

利用質(zhì)譜分析二硫鍵，以前由于二硫鍵多肽分子的二級質(zhì)譜圖非常復(fù)雜，質(zhì)譜分析需要大量人工進(jìn)行，費時費力且不能準(zhǔn)確有效。而現(xiàn)代生物質(zhì)譜學(xué)在最近十年發(fā)展非常迅速，大為提高了對蛋白質(zhì)分子的定性定量和翻譯后修飾的分析能力。

APT結(jié)合蛋白質(zhì)溶液內(nèi)的非還原酶解和LC-MS/MS，對供試品的二硫鍵配對方式進(jìn)行分析，明確供試品的各種鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵配對方式，并提供確定這些二硫鍵配對方式的實驗證據(jù)，包括一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)等。

“蛋白質(zhì)類藥物的二硫鍵配對組成是非常重要的理化性質(zhì)”

技術(shù)指標(biāo)

本方法所檢測的樣品是蛋白質(zhì)或多肽類供試品，測量的是二硫鍵所在多肽分子的分子量，測定的是該多肽分子的氨基酸序列和二硫鍵配對方式。蛋白質(zhì)或者多肽供試品既可以是固體樣品，也可以是溶液樣品，供試品量不應(yīng)少于200μg。供試品如果為固體，應(yīng)為蛋白質(zhì)多肽凍干制品；如果為液體，樣品中蛋白質(zhì)多肽濃度應(yīng)盡可能在2mg/ml以上。

本方法檢測是二硫鍵配對方式和其所在多肽分子的氨基酸序列。二硫鍵所在多肽分子的分子量與理論值相差小于2 Da，其二級碎片分子量與理論值相差小于0.8 Da。對還原前后的二硫鍵所在多肽分子做色譜質(zhì)譜圖分析（XICs），其信號峰面積需有顯著差異。

二硫鍵測定方法所使用的儀器是，Thermo公司和GE公司生產(chǎn)的高校液相串聯(lián)質(zhì)譜儀LTQ-Velos質(zhì)譜儀和Ettan MDLC色譜系統(tǒng)。

案例分析

下圖顯示一個還原前后的蛋白質(zhì)藥物的二硫鍵分析圖譜（XIC of LC-MS/MS）。

圖為還原前后的蛋白質(zhì)藥物的二硫鍵分析圖譜（XIC of LC-MS/MS）

下圖為蛋白質(zhì)類供試品二硫鍵組成分析的MS/MS圖譜。

圖為蛋白質(zhì)類供試品二硫鍵組成分析的MS/MS圖譜

Q&A

簡單介紹一下二硫鍵組成分析的實驗參數(shù)。