HPLC純度（反相 / 分子篩）

——即蛋白質(zhì)藥物的HPLC純度測(cè)定技術(shù)服務(wù)

用高效液相色譜（HPLC）的方法，根據(jù)蛋白質(zhì)保留時(shí)間的差異分離蛋白質(zhì)，通過(guò)峰面積積分測(cè)定蛋白質(zhì)的純度。利用樣品中各組分在色譜柱內(nèi)借助于固定相及流動(dòng)相的某種物理、化學(xué)作用在固定相與流動(dòng)相之間分配行為的不同來(lái)進(jìn)行分離的，其分離機(jī)制有吸附、分配、離子交換、分子排阻、疏水作用、親和力等，而色譜柱是色譜分離系統(tǒng)的核心部分，裝有不同類型填料的色譜柱與相對(duì)應(yīng)的流動(dòng)相形成不同分離機(jī)制，對(duì)絕大多數(shù)的有機(jī)化合物進(jìn)行分離分析。

“HPLC法測(cè)定蛋白質(zhì)類藥物的純度，是一項(xiàng)基本的生物化學(xué)分析技術(shù)”

技術(shù)指標(biāo)

◆  樣品要求：

蛋白或肽的總濃度不低于0.5μg/μl，體積不少于50μl，并標(biāo)明準(zhǔn)確濃度，如果需要脫鹽及樣品濃縮的需要，請(qǐng)說(shuō)明并標(biāo)明緩沖液成分。

◆  測(cè)定參數(shù)：

案例分析

◆  反相HPLC純度方法實(shí)驗(yàn)參數(shù)：

流動(dòng)相A：0.1%三氟乙酸的水溶液；流動(dòng)相B：0.1%三氟乙酸的乙腈溶液；流速：1ml/min；柱溫：30℃；梯度洗脫：70min（A液從97% ~ 30%，B液從3% ~ 70%）；檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm。

結(jié)果譜圖：

圖為胰島素標(biāo)準(zhǔn)品在反相HPLC柱上的純度分析圖譜

◆  分子篩HPLC純度方法實(shí)驗(yàn)參數(shù)：

流動(dòng)相：100% 0.1M PB+0.1M NaCL，pH7.0；流速：0.5ml/min；等度洗脫：30min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm。

圖為胰島素標(biāo)準(zhǔn)品在GSK 3000sw柱上的分析圖譜（分子篩）

Q&A

1)     反相和分子篩HPLC方法的比較。

反相色譜固定相大多是硅膠表面鍵合疏水基團(tuán)，基于樣品中的不同組分和疏水基團(tuán)之間疏水作用的不同而分離。

分子篩色譜以多孔凝膠作為固定相，依據(jù)樣品分子量大小達(dá)到分離目的。大分子不進(jìn)入凝膠孔洞，沿多孔凝膠膠粒間隙流出，先被洗脫；小分子進(jìn)入大部分凝膠孔洞，在柱中被強(qiáng)滯留，后被洗脫。

2)     HPLC純度分析中的定量分析方法介紹。

在HPLC純度分析中應(yīng)用到的定量分析方法為峰面積歸一法，該方法不需要標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)幫助來(lái)進(jìn)行定量，而是直接通過(guò)峰面積或者峰高進(jìn)行歸一化計(jì)算從而得到待測(cè)組分的含量。其特點(diǎn)是不需要標(biāo)準(zhǔn)物，只需要一次進(jìn)樣即可完成分析。歸一化法兼具內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法兩種方法的優(yōu)點(diǎn)，不需要精確控制進(jìn)樣量，也不需要樣品的前處理；缺點(diǎn)在于要求樣品中所有組分都出峰，并且在檢測(cè)器的響應(yīng)程度相同，即各組分的絕對(duì)校正因子都相等。