病原微生物快速檢測方法及研究進展！

                                          病原微生物快速檢測方法及研究進展！
 
微生物菌種查詢網(wǎng)：進入21 世紀以來,感染性疾病仍然是危害人類健康的重大隱患,尤其是第三世界國家。WHO 宣布近30 年來,新發(fā)現(xiàn)了29 種新病原體。目前的現(xiàn)狀是造成感染性疾病的微生物種類日益復(fù)雜,常見病原微生物的威脅不僅沒有消除,而且出現(xiàn)了一些耐藥性菌株,如葡萄球菌、腸球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌等,加之一些新病原體的出現(xiàn),給臨床診斷和治療帶來了很大的困難。2003 年SARS 引起了全球性災(zāi)難和恐慌,今年又接連發(fā)生禽流感爆發(fā)、豬鏈球菌感染人類和牛炭疽感染人類事件,出現(xiàn)次數(shù)越來越頻繁等嚴峻的現(xiàn)實給病原微生物的檢測和診斷提出了更高的要求,同時,對病原菌的明確診斷也是合理用藥的基礎(chǔ)。因此,研究和發(fā)展各種病原微生物的檢測技術(shù),準(zhǔn)確、快捷地確認與檢測病原體,對感染性疾病的治療和預(yù)后有重要意義。
 
一、應(yīng)用生化方法對病原微生物進行檢測
生化方法檢測病原微生物實際上是測定微生物特異性酶。由于各種微生物所具有的酶系統(tǒng)不完全相同,對許多物質(zhì)的分解能力亦不一致。因此可利用不同底物產(chǎn)生的不同代謝產(chǎn)物來間接檢測該微生物內(nèi)酶的有無,從而達到檢測特定微生物的目的。如沙門氏菌能產(chǎn)生辛酯酶,這一性能是除沙門氏菌外的各屬腸桿菌科細菌所不具備的。根據(jù)這一特性,甄宏太等報道了快速檢測沙門氏菌的辛酯酶法。該方法是以42甲基傘形酮辛酯(MUCAP) 為底物,經(jīng)沙門氏菌的酶降解后,釋放出4MU ,在紫外燈下觀察其發(fā)出的藍色熒光。該方法簡便易行,從加入底物到紫外燈下觀察到出結(jié)果僅需幾分鐘即可完成。其靈敏度和特異性分別可達95 %和90 %。對與H2 S( + ) 反應(yīng)的沙門氏菌該法更為敏感,靈敏度和特異性均接近100 %。大腸埃希氏菌具β2葡萄糖醛酸酶,但以O(shè)157 : H7 為代表的腸出血性大腸埃希氏菌( EHEC) 卻不具此酶,故β2葡萄糖醛酸酶陰性已成為初步篩查EHEC 的重要特征。白色念珠菌具脯氨酸肽酶及N2已酰β2D 半乳糖苷酶,分別以合適的試劑檢測,兩酶均陽性即為白色念珠菌。
 
二、血清免疫學(xué)方法
免疫學(xué)技術(shù)是利用特異性抗原抗體反應(yīng),觀察和研究組織細胞、特定抗原(抗體) 的定性和定量技術(shù)。為了顯示和觀察這種抗原抗體反應(yīng),需要預(yù)先將某種標(biāo)記物結(jié)合到抗體上,借標(biāo)記物的熒光或酶的有色反應(yīng)、放射性或高電子密度,在光鏡或電鏡下進行定性、定位或定量研究。各種形式的免疫分析方法如放射免疫分析(RIA) 、酶免疫分析( EIA) 、間接酶聯(lián)免疫吸附( EL ISA) 、熒光免疫分析( FIA) 、生物發(fā)光免疫分析(BIA) 、化學(xué)發(fā)光免疫分析(CIA)等,直接檢測微生物或通過間接檢測微生物的成份及微生物代謝產(chǎn)物(如毒素) 檢出微生物。各大文獻數(shù)據(jù)庫提供的數(shù)據(jù)顯示,幾乎建立了所有病原體的血清學(xué)檢測方法,表明該方法也成為了一種實驗室常用的成熟的檢測技術(shù)。
 
1、熒光抗體技術(shù)
熒光抗體技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性,把熒光素作為抗原標(biāo)記物,在熒光顯微鏡下檢查呈現(xiàn)熒光的特異性抗原抗體復(fù)合物及其存在部位。熒光抗體技術(shù)的主要特點是特異性強、速度快、靈敏度高,但也存在許多的缺點,如非特異染色問題難以完全解決、操作程序較煩瑣、需要特殊的昂貴儀器(熒光顯微鏡) 和染色標(biāo)本不能長期保存等。用于快速檢測病原菌的熒光抗體技術(shù)主要有直接法和間接法。直接法是在檢測樣品上直接滴加已知特異性熒光標(biāo)記的抗血清,經(jīng)洗滌后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。間接法是在檢測樣品上滴加已知的細菌特異性抗體,待作用后經(jīng)洗滌,再加入熒光標(biāo)記的第二抗體。如市場上廣泛應(yīng)用的抗沙門氏菌熒光抗體和豬瘟熒光抗體。呂治林等報道的由美國同行所作的用炭疽桿菌細胞壁(CW2DFA) 和莢膜抗原(CAP2DFA) 特異的熒光標(biāo)記的單克隆抗體,可快速鑒別炭疽桿菌。
 
2、酶免疫技術(shù)
酶聯(lián)免疫技術(shù)是根據(jù)抗原- 抗體的免疫反應(yīng)與酶的高效催化作用原理有機結(jié)合,通過酶催化底物進而發(fā)生一系列的化學(xué)反應(yīng),使溶液呈現(xiàn)出顏色變化,從而顯示抗原抗體特異性反應(yīng)的存在。酶聯(lián)免疫技術(shù)的應(yīng)用,大大提高了檢測的敏感性和特異性,現(xiàn)已被廣泛地應(yīng)用于多種病原微生物的檢測。應(yīng)用單克隆抗體結(jié)合硝酸纖維膜上的斑點EL ISA 技術(shù),已成功地自患者的咽拭標(biāo)本中同時檢出可能存在的肺炎支原體、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和3 、7 型腺病毒。涂少華等用MP 膜結(jié)合蛋白抗原制備MP 單抗來建立雙抗體夾心EL ISA 檢測肺炎支原體抗原方法, 與PCR 方法的符合率達95 %; Gehring 等用酶聯(lián)免疫化學(xué)發(fā)光法( EL IMCL) 測定大腸桿菌O157 ∶H7 ,在PBS 緩沖液中,檢測極限約為7. 6 ×103 個活細胞。許多疾病的檢測都已有商品化的試劑盒出現(xiàn)。如直接自尿中檢出沙眼衣原體的商品試劑盒IDEIA2 Ⅲ。
 
三、分子生物學(xué)方法
分子生物學(xué)及分子遺傳學(xué)的發(fā)展,使人們對微生物的認識逐漸從外部結(jié)構(gòu)特征轉(zhuǎn)向內(nèi)部基因結(jié)構(gòu)特征,微生物的檢測也相應(yīng)的從生化、免疫方法轉(zhuǎn)向基因水平的檢測。
 
1、核酸雜交法
最初應(yīng)用于微生物檢測的分子生物學(xué)技術(shù)是基因探針方法,它是用帶有同位素標(biāo)記或非同位素標(biāo)記的DNA 或RNA 片段來檢測樣本中某一特定微生物核苷酸的方法。
核酸雜交有原位雜交、打點雜交、斑點雜交、Sort hern 雜交、Northern 雜交等,它們共同的特點是：(1) 都是應(yīng)用復(fù)性動力學(xué)原理; (2) 都必須有探針的存在。核酸分子探針又可根據(jù)它們的來源和性質(zhì)分為DNA 探針、cDNA 探針、RNA 探針及人工合成的寡聚核苷酸探針等。該法診斷的原理是通過標(biāo)記根據(jù)病原體核酸片段制備的探針與病原體核酸片段雜交,觀察是否產(chǎn)生特異的雜交信號。核酸探針技術(shù)具有特異性好、敏感性高、診斷速度快、操作較為簡便等特點。目前,已建立了多種病原體的核酸雜交檢測方法,尤其是近年來發(fā)展起來的熒光原位雜交技術(shù)(FISH) 更為常用。
 
2、PCR 及其衍生技術(shù)
PCR 技術(shù)又稱體外擴增技術(shù),自1985 年發(fā)明以來,因其高度靈敏性和良好的特異性受到了人們的高度重視,短短20 年的時間,各種各樣以PCR 為基礎(chǔ)的DNA 序列的擴增和檢測方法得到了迅猛發(fā)展,幾乎已應(yīng)用于基礎(chǔ)研究的各個領(lǐng)域,并且成為醫(yī)學(xué)臨床和檢驗部門強有力的分析工具。各種衍生技術(shù)如反轉(zhuǎn)錄PCR ( RT2PCR) 、多重PCR、巢式PCR、PCR 單鏈構(gòu)象多態(tài)性( PCR2SSCP ) 、RFL P、RAPD 技術(shù)、熒光定量PCR等。其中定量PCR 既可以用于臨床感染性疾病的診斷,又可用于監(jiān)測其療效。而DNA 測序分析可用于病原菌的鑒定和亞型的區(qū)分,以及同種病原菌不同菌株的區(qū)分。
 
3、基于16S rRNA 與Gya B 的檢測技術(shù)
隨著測序技術(shù)發(fā)展,DNA 大規(guī)模測序得以進行,傳統(tǒng)的依據(jù)形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)特征鑒定細菌的方法,在某些方面將可以被一種可定量、較精確的以可翻譯核苷酸序列為基礎(chǔ)的分析方法所取代。以核苷酸序列為基礎(chǔ)的方法,要求選擇合適的靶基因進行比較分析。
⑴以16S rRNA 為靶基因進行檢測　自Woese 等于1987 年首次運用rRNA 分析以來,rRNA 數(shù)據(jù)庫快速擴大起來,其成為研究細菌多樣性、進化、系統(tǒng)發(fā)育中被廣泛采用的序列。16SrRNA 存在于所有原核生物細胞中,它們相對穩(wěn)定且有較高的拷貝數(shù)(每個細胞幾千個拷貝) ,其序列中含可變區(qū)及高度保守區(qū),因此可設(shè)計群、屬、種特異性的探針。現(xiàn)階段各種常見細菌的16S rRNA 基因幾乎全部測序完成,16S rRNA 編碼基因的這些特點使之成為較理想的細菌基因分類的靶序列,逐漸成為細菌鑒定、分類的“金標(biāo)準(zhǔn)”。目前, 16SrRNA 檢測技術(shù)已在醫(yī)學(xué)界得到廣泛應(yīng)用,可以用現(xiàn)有病原菌標(biāo)準(zhǔn)菌株制作DGGE (變性梯度凝膠電泳) 標(biāo)準(zhǔn)marker , 然后對疑似“病原菌”擴增16SrRNA 進行DGGE 分析,這樣可以做到快速檢測。
⑵以Gya B 為靶基因進行檢測　以16SrRNA 為靶標(biāo)分析研究也存在著一些問題。如序列聯(lián)配時必須考慮到rRNA 二級結(jié)構(gòu); 各細菌中rRNA 基因拷貝數(shù)不同; rRNA 多拷貝的微生物中不同拷貝具有異質(zhì)性等,使得其不能很好地區(qū)分密切相關(guān)的菌種。促旋酶(gyrase) B 亞單位基因GyaB 除了具有16S rRNA 所具有的優(yōu)點外,其基因進化率高于核糖體基因,還有GyaB 在近乎全部細菌中呈單拷貝形式。有研究表明,基于GyaB 序列構(gòu)建的進化圖譜與基于DNA2DNA 雜交的相一致。因此, GyaB的分析特別適合于菌株的區(qū)別和鑒定。Fukushima等以Gya B 基因為靶基因設(shè)計基因芯片來檢測分枝桿菌屬,實驗結(jié)果顯示此芯片鑒別分枝桿菌達到種水平,并且能區(qū)別密切相關(guān)的菌種,如牛分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌,這對臨床治療具有重要的參考價值。而采用16S rRNA 序列數(shù)據(jù)構(gòu)建的DNA 探針陣列卻不能區(qū)別密切相關(guān)的分枝桿菌菌種。Yamamoto 等的報道與Fukushima 等的相一致,說明分析Gya B 基因序列對于在菌種水平鑒別細菌是快速而有效的方法。
 
四、分子生物學(xué)與免疫學(xué)相結(jié)合的方法
1、免疫PCR
免疫PCR(immuno polymerase chain reaction ,IM PCR) 是1992 年Sano 等建立的一種檢測微量抗原的高靈敏度技術(shù)。該技術(shù)把抗原抗體反應(yīng)的高特異性和聚合酶鏈反應(yīng)的高敏感性有機結(jié)合起來,它的基本原理是用一段已知DNA 分子標(biāo)記抗體作為探針,用此探針與待測抗原反應(yīng), PCR 擴增粘附在抗原抗體復(fù)合物上的這段DNA 分子,電泳定性,根據(jù)特異性PCR 產(chǎn)物的有無,來判斷待測抗原是否存在。目前,國內(nèi)外報道的免疫PCR 的敏感性一般比現(xiàn)行的EL ISA 法高102 ～105 倍。由于PCR 產(chǎn)物在抗原量未達到飽和前與抗原抗體復(fù)合物的量成正比,因此免疫PCR 還可用于抗原的半定量試驗。
2、PCR2EL ISA
PCR2EL ISA 法是PCR 與EL ISA 技術(shù)結(jié)合的檢測方法。其綜合了PCR ,分子雜交,和EL ISA 3種技術(shù)的優(yōu)點。主要用于檢測樣品中的特定基因。它引入地高辛(或生物素) 標(biāo)記的dN TP 或引物進行PCR 擴增,利用酶標(biāo)抗地高辛抗體(或酶標(biāo)記親和素) 進行EL ISA 檢測,代替了用于常規(guī)PCR 產(chǎn)物檢測的電泳方法,方便快捷,易于處理大量樣品,且其靈敏度比使用瓊脂糖凝膠電泳檢測方法高100倍,當(dāng)有適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)品時,還可進行定量測定。
 
五、用生物傳感器進行病原微生物的鑒定
生物傳感器是將新興的傳感器技術(shù)和分子診斷技術(shù)相結(jié)合而成的一種新技術(shù),是現(xiàn)代臨床診斷發(fā)展的一個新方向。生物傳感器包含兩部分,即分子識別器件和換能器。在待測物、識別器件以及轉(zhuǎn)換器件之間由一些生物、化學(xué)、生化作用或物理作用過程彼此聯(lián)系。由于生物傳感器檢測準(zhǔn)確、操作簡便等特點,近年來已經(jīng)在許多領(lǐng)域取得了很大的進展,在生物分子相互作用、藥物篩選、臨床診斷、食物檢測等領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用。其中臨床中用于病原體檢測的以DNA 生物傳感器最為常見。葛晶等利用大腸桿菌抗體的免疫吸附反應(yīng),使用集成化SPR 傳感器快速檢測大腸桿菌O157 : H7 ,采用親和素- 生物素系統(tǒng)放大檢測的反應(yīng)信號,并引入復(fù)合抗體作為二次抗體,使該傳感器對大腸桿菌的檢測限由106 cfu/ ml 下降到105 cfu/ ml 。Masarova 等用凝集素代替抗體用生物傳感器進行細菌鑒定,實驗證明該法在病原菌檢測中有很大的優(yōu)勢。華裔科學(xué)家陳建柱最新制成的生物傳感器,僅需20s 時間即可檢測出微量SARS 病毒、天花病毒及炭疽桿菌等的存在,從而達到可早期診斷出SARS 病毒感染者。盡管生物傳感器作為一種新的傳感元件近年來得到了很大的發(fā)展,許多光化學(xué)、電化學(xué)以及壓電晶體都相繼在生物傳感器中得到應(yīng)用。與常規(guī)的核酸和蛋白質(zhì)檢測相比,具有檢測準(zhǔn)確、操作簡單等特點,但由于它存在靈敏度不夠、容易受雜質(zhì)干擾等缺點,隨著研究的進一步深化和技術(shù)方法的改進,這些問題將會得到解決。
 
六、生物芯片
生物芯片技術(shù)是將生物大分子,如寡核苷酸、cDNA、基因組DNA、肽、抗原以及抗體等固定在諸如硅片、玻璃片、塑料片、凝膠和尼龍膜等固相介質(zhì)上形成生物分子點陣,當(dāng)待測樣品中的生物分子與生物芯片的探針分子發(fā)生雜交或相互作用后,利用激光共聚焦顯微掃描儀對雜交信號進行檢測和分析。根據(jù)生物芯片上探針的分子種類而將之分為DNA 芯片(即基因芯片) 和蛋白質(zhì)芯片。微生物檢測基因芯片是指用來檢測樣品中是否含有微生物目的核酸片段的芯片�；�于高通量、微型化和平行分析的特點,微生物檢測基因芯片在微生物病原體檢測、種類鑒定、功能基因檢測、基因分型、突變檢測、基因組監(jiān)測等研究領(lǐng)域中發(fā)揮著越來越重要的作用。
目前,許多細菌、病毒等病原體的基因組測序已經(jīng)完成,將許多代表各種微生物的特殊基因制成1張芯片,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄就可檢測樣本中有無病原體基因的表達及表達水平,由此判斷病人感染病原、感染進程以及宿主反應(yīng)等。這樣就大大提高了檢測效率�；�因芯片診斷病原菌的原理基于細菌的16S rRNA基因的高度保守性,由于RNA 易于降解,因此多采用檢測16S。
rRNA 所對應(yīng)染色體上的16S rDNA 序列。對16S rDNA 而言,如果出現(xiàn)3 個堿基以上的差異就可以斷定細菌不屬于同一種屬,因此可用于細菌的分類和鑒別。對病毒和耐藥性病原菌的檢測是通過將待測的特定基因(病毒特異性基因和耐藥基因) 經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄、PCR、逆轉(zhuǎn)錄、末端標(biāo)記等處理成標(biāo)記有熒光分子的核酸分子,然后與芯片上的探針進行雜交,用計算機對雜交信號進行處理,依信號和強度即可得出核酸含量。
目前,生物芯片技術(shù)尚未成熟,還存在著諸如技術(shù)成本高、芯片制備較為復(fù)雜、樣品準(zhǔn)備與標(biāo)記比較繁瑣、信號檢測的靈敏度有待提高等許多問題。盡管如此,它在預(yù)防疾病方面開辟了一條新途徑。
 
七、蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)
蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)是隨著蛋白質(zhì)組學(xué)興起的一種新技術(shù),用于各種疾病特異性蛋白指紋的識別和判斷,可以直接檢測不經(jīng)處理的尿液、血液或細胞裂解液等。人體血清里有成千上萬個蛋白,人一旦發(fā)生了某種疾病,蛋白質(zhì)成分就必然會起變化。中科院微生物所唐宏研究員等利用“蛋白質(zhì)質(zhì)譜指紋圖譜”最新技術(shù)及其檢測辦法,可以分析得出SARS與非SARS 病人血清中的蛋白質(zhì)成分變化。該技術(shù)不是利用單獨的蛋白質(zhì)峰的出現(xiàn)和消失來判斷SARS ,而是用5 個蛋白質(zhì)峰的出現(xiàn)和消失來判斷,好比刑偵破案中甄別5 個手指的指紋,故此稱為“指紋圖譜”。質(zhì)譜儀通過復(fù)雜的計算能夠記住SARS病人血清里蛋白質(zhì)的圖譜,通過對質(zhì)譜儀的“訓(xùn)練”之后,它就能夠根據(jù)人體血清中的特異變化,靈敏地辨別出測試的對象是否感染了SARS 病毒。這種檢測方法經(jīng)北京天壇醫(yī)院臨床檢測,陽性率接近95 % ,特異性將近96 %,能在病人發(fā)燒的第一天即可以得出滿意的檢測結(jié)果。只需要一滴血,將采集到的病人血樣現(xiàn)場直接放到9mol 濃度的尿素里,病毒可以迅速溶解滅活,這樣在一般醫(yī)院的化驗室里即可實現(xiàn)安全操作,從而防止交叉感染。有專家稱蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)標(biāo)志著一種劃時代的診斷模式的誕生。
 
八、結(jié)論與展望
綜上所述,病原的檢測方法多種多樣,各種方法都有其優(yōu)缺點,為了彌補各自的不足,進一步提高靈敏度和特異性,可以采用多種方法聯(lián)合使用的策略。選擇檢測方法應(yīng)考慮到自身所擁有的條件,檢測所要求達到的靈敏度,而提高靈敏度和去除假陽性是檢測方法發(fā)展的趨勢。
近年來,隨著計算機技術(shù)的不斷發(fā)展,臨床病原菌檢測將向著高度自動化和開發(fā)簡便的快速檢測技術(shù)兩個方向發(fā)展。分子生物學(xué)技術(shù)通過自動化儀器的使用,將在病原菌診斷、鑒定和耐藥基因檢測方面逐步應(yīng)用于臨床。生物芯片技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,最終將徹底改變臨床病原菌檢驗的現(xiàn)狀和傳統(tǒng)觀念,實現(xiàn)高效、高質(zhì)和廉價的統(tǒng)一。隨著各學(xué)科的交叉發(fā)展,會出現(xiàn)越來越多的新的檢測技術(shù)。

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