TAP-MS串聯(lián)親和純化質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)

TAP-MS串聯(lián)親和純化質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)原理

 

過表達(dá)TST-Flag雙標(biāo)簽融合蛋白的細(xì)胞，經(jīng)裂解后先與Streptactin珠子孵育、初次洗滌及洗脫，釋放出蛋白復(fù)合物；再將此蛋白復(fù)合物與anti-Flag珠子結(jié)合、再次洗滌，最后的洗脫產(chǎn)物用質(zhì)譜鑒定未知的互作蛋白。

 

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TAP-MS串聯(lián)親和純化質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)流程

 

 

 

 

應(yīng)用領(lǐng)域

 

 

 

 

 

 

TAP MS應(yīng)用背景

 

隨著確定細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的相互作用成為當(dāng)今生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)，雙雜交技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于研究蛋白—蛋白間的相互作用，但由于其篩選步驟復(fù)雜，假陽(yáng)性結(jié)果較多，難于量化，故不能滿足大規(guī)模蛋白質(zhì)研究的需要，因此串聯(lián)親和純化（TAP）技術(shù)以其高效、高純度、以及能夠高度模擬真實(shí)生理?xiàng)l件等優(yōu)勢(shì)，迅速成為篩選、發(fā)現(xiàn)和鑒別新的相互作用蛋白質(zhì)的主流技術(shù)之一。

目前，TAP技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)用，以及質(zhì)譜技術(shù)的自動(dòng)化，使得大規(guī)模地分析相互作用的蛋白質(zhì)在技術(shù)上成為可能。

TAP技術(shù)采用兩步親和純化，提高了純化產(chǎn)物的特異性，具有周期短、假陽(yáng)性結(jié)果少等優(yōu)點(diǎn)。通過這種方法鑒定到的蛋白質(zhì)相互作用能真實(shí)地反映出細(xì)胞中蛋白質(zhì)分子之間的聯(lián)系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加接近真實(shí)情況，而且TAP技術(shù)還特別適用于蛋白質(zhì)組水平上的大規(guī)模研究。

 

 

 

 

TAP-MS實(shí)驗(yàn)研究案例—客戶文章解析

 

 

 

鳥嘌呤核苷酸交換因子的差異rac1信號(hào)涉及FLII在調(diào)節(jié)rac1驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞遷移中的作用

 

研究背景

 

小的GTP酶 rac1與腫瘤的形成和擴(kuò)散有關(guān)。當(dāng)被鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)激活時(shí)，rac1與細(xì)胞中的各種蛋白質(zhì)結(jié)合，從而調(diào)節(jié)各種功能，包括細(xì)胞遷移。然而，當(dāng)在臨床環(huán)境中以rac1為靶點(diǎn)時(shí)，rac1的激活可以導(dǎo)致相反的遷移表型，增加了加劇腫瘤進(jìn)展的可能性。這就需要確定影響rac1驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的因素。

 

 

研究路線

1

過表達(dá)與 pull down實(shí)驗(yàn)證實(shí)Tiam1和P-Rex1誘導(dǎo)不同的rac1下游效應(yīng)

2

通過TAP/ SILAC結(jié)合的方法檢測(cè) Tiam1或 P-Rex1誘導(dǎo)后的rac1相互作用體，證實(shí)Tiam1和P-Rex1對(duì)racl互動(dòng)體有不同的調(diào)控作用

3

免疫共沉淀、 GST pull down和PLA實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)FLII優(yōu)先與活性racl結(jié)合FLII是一種新的富含P-RExl的rac1結(jié)合伙伴

4

結(jié)構(gòu)域分析證實(shí)FLII通過不同的結(jié)構(gòu)域與rac1和P-Rex1結(jié)合

5

Pull down實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)FLII是P-REx1-rac1驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞遷移所必需的

6

基因敲除實(shí)驗(yàn)表明P-Rex1可以通過FLII介導(dǎo)特定的細(xì)胞功能，包括細(xì)胞收縮，從而促進(jìn)細(xì)胞遷移

 

 

研究結(jié)論

 

研究證實(shí)P-Rex1不僅能激活rac1，而且還能將蛋白質(zhì)(如FLII)定向到rac1的活性形式，以介導(dǎo)特定的細(xì)胞功能，包括細(xì)胞收縮，從而使P-Rex1能夠促進(jìn)細(xì)胞遷移。因此，這項(xiàng)研究提供了對(duì)以前未報(bào)道的P-REx1-rac1介導(dǎo)細(xì)胞遷移的細(xì)胞功能的洞察力，并強(qiáng)調(diào)了P-Rex1和rac1可能驅(qū)動(dòng)癌癥擴(kuò)散的其他模式。

 

 

客戶文獻(xiàn)

 

Hadir Marei. et al: Differential Rac1 signalling by guanine nucleotideexchange factors implicates FLII in regulating Rac1-driven cell migration.Nat Communications. 2016，IF=14.919.