DNA pull down技術(shù)服務(wù)

先將含脫硫生物素的DNA pulldown探針結(jié)合到鏈霉親和素Beads上，再將DNA-Beads和細(xì)胞裂解液孵育，這樣DNA結(jié)合蛋白便一起吸附在Beads上。洗滌掉未結(jié)合的蛋白后，再用洗脫液將DNA結(jié)合蛋白從Beads洗脫下來(lái)，得到DNA pull down產(chǎn)物。DNA-protein復(fù)合物既可以用WesternBlot檢測(cè)已知蛋白，也可以用質(zhì)譜鑒定未知蛋白。

DNA pull-down技術(shù)服務(wù)應(yīng)用背景

DNA pull-down以感興趣的DNA序列為中心，尋找與該序列結(jié)合的蛋白質(zhì)，最常見的應(yīng)用是尋找某特定基因啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子。

啟動(dòng)子通常位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游，含有RNA聚合酶特異性結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始所需的保守序列。

轉(zhuǎn)錄因子也稱為反式作用因子，是一種DNA結(jié)合蛋白，它能夠與真核基因的順式作用元件（如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等）特異性結(jié)合來(lái)激活或抑制基因表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子有4個(gè)主要結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合域決定了轉(zhuǎn)錄因子的特異性，轉(zhuǎn)錄調(diào)控域（包括激活域或抑制域）決定了轉(zhuǎn)錄因子的功能，寡聚化位點(diǎn)使不同轉(zhuǎn)錄因子間發(fā)生相互作用，核定位信號(hào)控制轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核。

一個(gè)基因的啟動(dòng)子通常會(huì)結(jié)合多種轉(zhuǎn)錄因子，尋找啟動(dòng)子序列的特異轉(zhuǎn)錄因子，有助于我們理解這些啟動(dòng)子下游的功能基因是如何被調(diào)控的。

鼻咽癌的已有研究指出，氯離子通道-3(CLC-3)是一種有應(yīng)用前景的癌癥生物標(biāo)志物；但是，CLC-3能否作為胃癌的預(yù)后生物標(biāo)志物以及它在胃癌中的作用機(jī)制卻鮮有報(bào)道。

1 免疫組化實(shí)驗(yàn)表明CLC-3在胃痦組織中高表達(dá)，且與患者不良預(yù)后有關(guān)

2 RNA-seq分析和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲除CLC-3抑制細(xì)胞增殖和遷移，且影響了PI3K/Akt信號(hào)通路的很多基因

3 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)確定了CLC-3啟動(dòng)子的活性區(qū)域

4 DNA pull down MS實(shí)驗(yàn)找到了CLC-3啟動(dòng)子活性區(qū)域的潛在結(jié)合蛋白XRCC5

5 體內(nèi)DNA探針檢測(cè)和ChIP-PCR實(shí)驗(yàn)都確定了XRCC5蛋白可以結(jié)臺(tái)CLC-3啟動(dòng)子

6 免疫組化實(shí)驗(yàn)表明XRCC5和CLC-3的表達(dá)呈正相關(guān)，且兩者高表達(dá)指示患者預(yù)后不良

7 基因表達(dá)/敲除和細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CLC-3的表達(dá)和功能受XRCC5的調(diào)節(jié)

8 CoIP結(jié)合質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)篩選到了XRCC5的互作蛋白PARP1，體內(nèi)DNA探針檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PARP1也可以與CLC-3啟動(dòng)子結(jié)合，XRCC5和PARP1協(xié)同調(diào)控CLC-3的表達(dá)和功能

9 小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)表明CLC-3在體內(nèi)可也以被XRCC5調(diào)控，影響腫瘤生長(zhǎng)

CLC-3過(guò)表達(dá)是胃癌不良預(yù)后的生物標(biāo)志物，并且CLC-3可能通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移。胃癌中CLC-3過(guò)表達(dá)的調(diào)控機(jī)制是：XRCC5結(jié)合CLC-3啟動(dòng)子區(qū)并增加其啟動(dòng)子活性，并且與PARP1相互作用在轉(zhuǎn)錄水平正調(diào)控CLC-3的表達(dá)。

Gu Z.Y. et al: Overexpression of CLC-3 is regulated by XRCC5 and is a poor prognostic biomarker for gastric cancer. Journal of Hematology & Oncology. 2018. (IF=17.388).