ChIP染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)服務(wù)-chip實(shí)驗(yàn)原理及流程

ChIP（chromatin immunoprecipitation assay, 染色質(zhì)免疫共沉淀）是研究體內(nèi)DNA與蛋白結(jié)合的重要技術(shù)，主要包括ChIP-qPCR和ChIP-seq兩種；其中ChIP-qPCR用來(lái)驗(yàn)證與目標(biāo)蛋白結(jié)合的已知DNA片段，ChIP-seq用來(lái)篩選與目標(biāo)蛋白結(jié)合的未知DNA片段。

先用甲醛交聯(lián)細(xì)胞內(nèi)“蛋白-DNA”復(fù)合物，并用超聲波破碎DNA至適合的長(zhǎng)度。細(xì)胞裂解后，孵育結(jié)合了抗體的珠子，誘餌蛋白通過(guò)其抗體便結(jié)合到了Beads上，同時(shí)和誘餌蛋白互作的DNA，也一起沉淀到Beads上。洗滌掉未結(jié)合的DNA后，再用洗脫液將DNA-蛋白復(fù)合物從Beads洗脫下來(lái)，便得到染色質(zhì)免疫共沉淀產(chǎn)物。DNA-蛋白復(fù)合物去交聯(lián)后，既可qPCR檢測(cè)已知DNA片段，也可用二代測(cè)序與蛋白互作的DNA片段。

當(dāng)沒(méi)有合適的誘餌蛋白抗體時(shí)，可以通過(guò)表達(dá)融合了flag標(biāo)簽的誘餌蛋白，利用flag標(biāo)簽做免疫沉淀。即細(xì)胞過(guò)表達(dá)Flag-Bait，經(jīng)裂解后與anti-Flag珠子孵育，誘餌融合蛋白與Beads結(jié)合，與誘餌融合蛋白互作的DNA“共沉淀”到Beads上，再經(jīng)洗滌、洗脫后做qPCR或NGS測(cè)序。

染色質(zhì)免疫沉淀ChIP實(shí)驗(yàn)流程-輝駿生物

帶標(biāo)簽的染色質(zhì)免疫共沉淀流程圖：

應(yīng)用領(lǐng)域

ChIP技術(shù)應(yīng)用背景

◆ 基因表達(dá)是一個(gè)復(fù)雜、調(diào)控有序的過(guò)程，DNA與蛋白質(zhì)的相互作用是基因轉(zhuǎn)錄起始和調(diào)控的關(guān)鍵，研究它們的相互作用是研究染色質(zhì)上基因表達(dá)調(diào)控的重要領(lǐng)域。

◆ chip（染色質(zhì)免疫共沉淀）是檢測(cè)體內(nèi)條件下DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法，該技術(shù)由 Orlando等于1997年創(chuàng)立，目前已廣泛應(yīng)用于組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄因子作用位點(diǎn)和DNA甲基化等研究中。

◆ 轉(zhuǎn)錄因子也稱(chēng)為反式作用因子，是指能夠與真核基因的順式作用元件發(fā)生特異性相互作用來(lái)激活或抑制基因表達(dá)的DNA結(jié)合蛋白。轉(zhuǎn)錄因子有4個(gè)主要結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合域決定了轉(zhuǎn)錄因子的特異性，轉(zhuǎn)錄調(diào)控域（包括激活域或抑制域）決定了轉(zhuǎn)錄因子的功能，寡聚化位點(diǎn)使不同轉(zhuǎn)錄因子間發(fā)生相互作用，核定位信號(hào)控制轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核。

◆ 組蛋白是染色質(zhì)基本結(jié)構(gòu)——核小體中的重要組成部分，其N(xiāo)-端尾部暴露在核小體的表面，可發(fā)生乙�；�、甲基化、磷酸化、泛素化、多聚 ADP 糖基化等共價(jià)修飾，影響組蛋白與DNA的親和性，改變?nèi)旧�質(zhì)的疏松或凝集狀態(tài)，或影響其它轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動(dòng)子的親和性，激活或抑制基因表達(dá)。

◆ DNA甲基化是在不改變DNA序列的前提下，由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將S-腺苷甲硫氨酸(SAM)上的甲基轉(zhuǎn)移到DNA上，其中發(fā)生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化（5-mC）是DNA甲基化的主要形式。甲基的引入使DNA分子空間結(jié)構(gòu)改變，DNA大溝無(wú)法與DNA結(jié)合蛋白（轉(zhuǎn)錄因子、拓?fù)洚悩?gòu)酶、RNA聚合酶、阻抑蛋白等）正常結(jié)合，導(dǎo)致某些基因轉(zhuǎn)錄失活。因此，DNA甲基化通常抑制基因表達(dá)，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。

研究者首先發(fā)現(xiàn)Ncor1(編碼NCoR)和Ncor2(編碼SMRT)在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)、胚胎干細(xì)胞(ESC)和OSKM重編程細(xì)胞中均有表達(dá)。無(wú)論用怎樣的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法、報(bào)告系統(tǒng)、MEF類(lèi)型或培養(yǎng)基，抑制Ncor1/2的表達(dá)都能增強(qiáng)OSKM誘導(dǎo)的重編程。

本研究發(fā)現(xiàn)NCoR/SMRT–HDAC3共抑制復(fù)合物通過(guò)與OSKM因子（尤其是c-MYC）相互作用為重編程制造障礙，這一發(fā)現(xiàn)揭示了c-MYC在重編程中的雙重作用，也有助于解釋為何用OSKM而非OSK誘導(dǎo)重編程更容易產(chǎn)生pre-iPSCs，以及為何用HDAC抑制劑對(duì)OSKM而非OSK誘導(dǎo)的重編程能產(chǎn)生更強(qiáng)的效果等問(wèn)題。

Zhuang Q. et al: NCoR/SMRT co-repressors cooperate with c-MYC to create an epigenetic barrier to somatic cell reprogramming. Nature Cell Biology. 2018. (IF=28.824)

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