蛋白質(zhì)純化方法總結(jié)

分離純化某一特定蛋白質(zhì)的一般程序可以分為前處理、粗分級(jí)、細(xì)分級(jí)三步。

1.前處理：分離純化某種蛋白質(zhì)，首先要把蛋白質(zhì)從原來(lái)的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來(lái)并保持原來(lái)的天然狀態(tài)（如果做不到呢？比如蛋白以包涵體形式存在），不丟失生物活性。為此，動(dòng)物材料應(yīng)先提出結(jié)締組織和脂肪組織，種子材料應(yīng)先去殼甚至去種皮以免手單寧等物質(zhì)的污染，油料種子最好先用低沸點(diǎn)（為什么呢）的有機(jī)溶劑如乙醚等脫脂。然后根據(jù)不同的情況，選擇適當(dāng)?shù)姆椒�，將組織和細(xì)胞破碎。動(dòng)物組織和細(xì)胞可用電動(dòng)搗碎機(jī)或勻漿機(jī)破碎或用超聲波處理破碎。植物組織和細(xì)胞由于具有纖維素、半纖維素和果膠等物質(zhì)組成的細(xì)胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和適當(dāng)?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ɑ蛴美w維素酶處理也能達(dá)到目的。細(xì)菌細(xì)胞的破碎比較麻煩，因?yàn)檎麄�(gè)細(xì)菌細(xì)胞壁的骨架實(shí)際上是一個(gè)借共價(jià)鍵連接而成的肽聚糖囊狀大分子，非常堅(jiān)韌。破碎細(xì)菌細(xì)胞壁的常用方法有超聲波破碎，與砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理等。組織和細(xì)胞破碎后，選擇適當(dāng)?shù)木彌_液把所要的蛋白提取出來(lái)。細(xì)胞碎片等不溶物用離心或過(guò)濾的方法除去。
如果所要的蛋白主要集中在某一細(xì)胞組分，如細(xì)胞核、染色體、核糖體或可溶性細(xì)胞質(zhì)等，則可利用差速離心的方法將它們分開(kāi)，收集該細(xì)胞組分作為下步純化的材料。如果碰上所要蛋白是與細(xì)胞膜或膜質(zhì)細(xì)胞器結(jié)合的，則必須利用超聲波或去污劑使膜結(jié)構(gòu)解聚，然后用適當(dāng)介質(zhì)提取。

2. 粗分級(jí)分離：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)提取液（有時(shí)還雜有核酸、多糖之類(lèi)）獲得后，選用一套適當(dāng)?shù)姆椒�，將所要的蛋白與其他雜蛋白分離開(kāi)來(lái)。一般這一步的分離用鹽析、等電點(diǎn)沉淀和有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法。這些方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、處理量大，既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白溶液。有些蛋白提取液體積較大，又不適于用沉淀或鹽析法濃縮，則可采用超過(guò)濾、凝膠過(guò)濾、冷凍真空干燥或其他方法進(jìn)行濃縮。

3.細(xì)分級(jí)分離：樣品經(jīng)粗分級(jí)分離以后，一般體積較小，雜蛋白大部分已被除去。進(jìn)一步純化，一般使用層析法包括凝膠過(guò)濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等。必要時(shí)還可選擇電泳法，包括區(qū)帶電泳、等電點(diǎn)聚焦等作為最后的純化步驟。用于細(xì)分級(jí)分離的方法一般規(guī)模較小，但分辨率很高。

結(jié)晶是蛋白質(zhì)分離純化的最后步驟。盡管結(jié)晶過(guò)程并不能保證蛋白一定是均一的，但是只有某種蛋白在溶液中數(shù)量上占有優(yōu)勢(shì)時(shí)才能形成結(jié)晶。結(jié)晶過(guò)程本身也伴隨著一定程度的純化，而重結(jié)晶又可除去少量夾雜的蛋白。由于結(jié)晶過(guò)程中從未發(fā)現(xiàn)過(guò)變性蛋白，因此蛋白的結(jié)晶不僅是純度的一個(gè)標(biāo)志，也是斷定制品處于天然狀態(tài)的有力指標(biāo)。

蛋白質(zhì)分離純化的方法：

一、根據(jù)分子大小不同的純化方法
1、透析和超過(guò)濾
2、密度梯度離心
3、凝膠過(guò)濾

二、利用溶解度差別的純化方法
1、等電點(diǎn)沉淀和pH控制
2、蛋白質(zhì)的鹽析和鹽溶
3、有機(jī)溶劑分級(jí)分離法
4、溫度對(duì)蛋白質(zhì)濃度的影響

三、根據(jù)電荷不同的純化方法
1、電泳
2、聚丙烯酰胺凝膠電泳
3、毛細(xì)管電泳
4、等電聚焦
5、層析聚焦
6、離子交換層析

四、利用選擇性吸附的純化方法
1、羥磷石灰層析
2、疏水作用層析

五、利用配體的特異生物學(xué)親和力的純化方法
親和層析（affinity chromatography）：
a.凝集素親和層析
b.免疫親和層析
c.金屬螯合層析
d.染料配體層析
e.共價(jià)層析

六、高效液相層析合快速蛋白質(zhì)液相層析