核酸提取實驗原理、純化方法及應(yīng)用領(lǐng)域
一，什么是核酸酶
核酸是一類由核苷酸聚合成的生物大分子，是構(gòu)成生命所必需的基本物質(zhì)之一，在生命系統(tǒng)中主要起到作為遺傳信息載體的作用，主要分為脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），其中RNA又可以根據(jù)功能的不同分為核糖體RNA(r RNA)，信使RNA（m RNA）和轉(zhuǎn)運RNA（t RNA）等。
核酸廣泛存在于所有動植物細胞、微生物內(nèi)、生物體內(nèi)，常與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白。不同的核酸，其化學(xué)組成、核苷酸排列順序等不同。DNA主要集中在細胞核內(nèi)，線粒體和葉綠體中，而RNA主要分布在細胞質(zhì)當(dāng)中。
二，核酸提取類型
1，總RNA提取
總RNA中，75-85%為rRNA（主要是28S-26S/23S和18S/16S rRNA），其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、5S rRNA、5.8S rRNA、miRNA、siRNA、小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）及核仁小分子RNA（small nuceolar RNA，snoRNA）等組成。
2，miRNA提取
MicroRNAs（miRNAs）是小型的、高度保守的RNA分子，如小干擾RNAs（siRNAs），通過與他們的堿基配對調(diào)節(jié)其同源mRNA的分子表達，以預(yù)防通過各種機制的表達。他們已成為進行發(fā)育、細胞增殖、分化和細胞周期的重點監(jiān)管機構(gòu)。
3，基因組DNA提取
進行基因結(jié)構(gòu)和功能研究以及基因診斷，通常要求得到的片段長度不小于100～200kb。在DNA提取過程中應(yīng)盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為后續(xù)的實驗打下基礎(chǔ)。
4，質(zhì)粒抽提
質(zhì)粒抽提方法即去除RNA，將質(zhì)粒與細菌基因組 DNA分開，去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)，以得到相對純凈的質(zhì)粒。
5，cfDNA提取和cfRNA提取
三，傳統(tǒng)核酸酶提取實驗原理
核酸提取實驗涉及到兩個基本原理：細胞裂解和核酸沉淀。
1，細胞裂解是將DNA從細胞壁和細胞膜中釋放出來的過程，在此過程中，各種物理和化學(xué)手段如冰凍-破碎、酶解和離子交換等可以使細胞破裂，釋放出核酸；
2，核酸沉淀則是將DNA從其他雜質(zhì)中分離出來的過程。這里的關(guān)鍵技巧是利用離心機和酒精洗滌。離心機的高速旋轉(zhuǎn)讓細胞碎片沉積在管底，而酒精則幫助DNA在管壁上形成白色絮狀物，方便我們提取。
四，核酸提取純化方法解決
1，煮沸裂解法
此法一般用于DNA的手工提取。染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大很多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)裝分子；當(dāng)加熱處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉合的質(zhì)粒DNA在冷卻時即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。
2，磁珠法
對超順磁性納米顆粒的表面進行改良和表面修飾后，制備成超順磁性氧化硅納米級磁珠。該磁珠能與核酸分子特異性結(jié)合。利用氧化硅納米微球的超順磁性，在Chaotropic鹽(鹽酸胍、異硫氰酸胍等)和外加磁場的作用下，從血液、動物組織、食品、病原微生物等樣本中分離出DNA和RNA。
3，酚氯仿抽法
主要是使用兩種不同的有機溶劑交替抽提將蛋白去除。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與DNA的聯(lián)結(jié)鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶，同時苯酚抑制了DNase的降解作用，蛋白質(zhì)分子溶于酚相，而DNA溶于水相。離心分層后取出水層，多次重復(fù)操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀DNA。離心后，DNA可取出。
4，陰離子去污劑法
用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)變性，可以直接從生物材料中提取DNA。由于細胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合，同時陰離子去污劑能夠破壞這種價鍵，所以常用陰離子去污劑提取DNA。
5，離心柱法
通過特殊硅基質(zhì)吸附材料，能夠特定吸附DNA，而RNA和蛋白質(zhì)順利通過，然后利用高鹽低PH結(jié)合核酸，低鹽高PH值洗脫，來分離純化核酸。離心柱純化也是試劑盒提取中廣泛的使用方法。
6，熱裂解堿法
堿裂解法是基于DNA的變性與復(fù)性差異而達到分離目的的。堿性使質(zhì)粒DNA變性，再將pH值調(diào)至中性使其復(fù)性，復(fù)性的為質(zhì)粒DNA，而染色體DNA不會復(fù)性，纏結(jié)成網(wǎng)狀物質(zhì)，通過離心除去。
7，CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法）
CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，具有從低離子強度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。通過有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。
8，其他方法
除了上述常用的方法之外，還有超聲法、酶解法及濃鹽法等等多種方法。
五，核酸分離注意事項與方案選擇
1，注意事項
分離純化核酸時，為了保證核酸結(jié)構(gòu)與功能的研究，完整的一級結(jié)構(gòu)是最基本的要求，因為遺傳信息全部貯存在一級結(jié)構(gòu)之中，核酸的一級結(jié)構(gòu)還決定其高級結(jié)構(gòu)的形式以及和其它生物大分子結(jié)合的方式。
➤ 盡量簡化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對核酸的破壞；
➤ 減少化學(xué)因素對核酸的降解，為避免過酸、過堿對核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在 pH4 - 10 的條件下進行；
➤ 減少物理因素對核酸的降解，物理降解因素主要是機械剪切力，其次是高溫；
➤ 防止核酸的生物降解，細胞內(nèi)或外來的各種核酸酶消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級結(jié)構(gòu)。
2，方案選擇
想要拿到好實驗結(jié)果，我們應(yīng)該先學(xué)會根據(jù)具體的實驗材料和實驗要求來選擇合適的方法。核酸提取的方案，應(yīng)根據(jù)具體生物材料和待提取的核酸分子的特點而定，對于某特定細胞器中富集的核酸分子，事先提取該細胞器，然后提取目的核酸分子的方案，可獲得完整性和純度兩方面質(zhì)量均高的核酸分子。
六，核酸純化提取應(yīng)用領(lǐng)域
核酸純化系統(tǒng)/核酸提取儀廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究和臨床診斷中的核酸提取和純化過程。具體應(yīng)用包括以下幾個方面：
1，基因組學(xué)研究：核酸純化系統(tǒng)可以用于從細胞、組織或體液樣本中提取并純化核酸，為基因組測序、SNP分析、CNV和突變檢測等提供高質(zhì)量的DNA/RNA樣品。
2，蛋白質(zhì)研究：核酸純化系統(tǒng)可以用于從細胞裂解液中去除蛋白質(zhì)，使得后續(xù)的核酸分析更加準(zhǔn)確和靈敏。在研究蛋白質(zhì)-DNA/RNA相互作用、染色質(zhì)組裝和修飾等方面具有重要作用。
3，臨床診斷：核酸純化系統(tǒng)在臨床診斷中非常重要。它可以用于從患者樣本中提取并純化病原體的核酸，以進行疾病診斷、藥物敏感性分析和基因檢測等。常見的應(yīng)用包括病毒核酸提取、細菌分離和基因突變篩查等。
4，法醫(yī)學(xué)和遺傳學(xué)：核酸純化系統(tǒng)可以用于DNA提取和純化，以進行法醫(yī)學(xué)鑒定、親子關(guān)系鑒定、人類遺傳學(xué)研究等。這些研究和應(yīng)用需要高質(zhì)量的DNA樣本，核酸純化系統(tǒng)能夠提供符合要求的純化效果。
逐典Pannarase全能核酸酶優(yōu)勢：
1.無動物源性、無氨芐青霉素
2.杰出單位比酶活、更高效的核酸降解能力
3.先進的生產(chǎn)工藝，非傳統(tǒng)His標(biāo)簽純化、排除引入金屬離子風(fēng)險
4.嚴(yán)格的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，內(nèi)毒水平低，確保單位酶活的準(zhǔn)確性以及批次間穩(wěn)定性
全能核酸酶應(yīng)用條件：
全能核酸酶的酶活會受到多種因素的影響（例如溫度、pH、離子強度等），故用量范圍也會從0.1 U/mL-250 U/mL不等。因此，不同的操作環(huán)境下酶的最佳濃度不同，需要通過實驗設(shè)置梯度進行最佳條件的摸索。
