磁珠的DNA純化自動化解決方案操作流程詳解
使用基于磁珠的DNA純化已成為NGS文庫制備的金標準。盡管這是一種快速簡便的方法，但高通量測序成本的降低和單細胞測序的普及使待處理的樣本大大地增加。C.WASH兼容磁性板載體，采用獨特的非接觸式注液和反向離心移除液體的方式，支持在96和384微孔板中自動完成基于磁珠的DNA純化這一工作流程。
圖1. C.WASH非接觸式微孔板樣品處理系統(tǒng)
C.WASH的這些功能有助于簡化和標準化磁珠清洗，加快NGS文庫制備工作流程，并確保在液體移除或試劑分配過程中不會發(fā)生孔間交叉污染。
案例一：使用C.WASH進行DNA自動純化樣品交叉污染的可能性
在此實驗中，我們利用哺乳動物基因組DNA中占很大比例的串聯(lián)重復序列對C.WASH進行評估，因為主要衛(wèi)星重復序列（MSRs）由234個堿基對（bp）單體的重復序列組成，這些單體在著絲粒周圍區(qū)域富集并參與異染色質(zhì)的形成。它們在基因組中的豐度以及相對較小的長度使MSR成為定量聚合酶鏈式反應（qPCR）中檢測交叉污染的理想指標。
圖2為使用C.WASH純化的工作流程：
1. 使用C.WASH移除上清液（離心力10g）
2. 使用C.WASH加入70%乙醇（20µL），等待30s
3. 使用C.WASH移除70%乙醇（離心力10g）
4. 使用C.WASH重復乙醇洗滌（步驟2和3）
5. 在室溫下放置樣品2min
6. 使用C.WASH加入20µL 超純水，孵育2min以重新水合
實驗結果
案例二：scRNA-seq文庫制備中的DNA純化
將HEK293FT(人類)和NIH3T3(小鼠)細胞經(jīng)FACS分選后，交替鋪到384孔板上，中間一行(H)作為陰性對照，如圖4所示。經(jīng)Smart-seq3儀器合成和擴增cDNA后，分別使用C.WASH和另外一種液體處理儀器BRAVO對磁珠進行清洗，并對比清洗效果。
表1. BRAVO和C.WASH的磁珠清洗流程對比
圖4. C.WASH和BRAVO實現(xiàn)文庫的可視化
圖5. 使用C.WASH和BRAVO清洗后相應基因組的讀取數(shù)
實驗結果
案例三：采用C.WASH純化PCR產(chǎn)物的DNA
SMART-seq2文庫制備后，分別對未純化的cDNA進行手工清洗和使用C.WASH清洗，然后通過生物分析儀檢測對比結果。
圖6. 手工清洗和C.WASH清洗DNA純化中的磁珠工作流程示意圖
圖7. 手工清洗和C.WASH清洗結果對比圖
實驗結果
1. 非接觸式清洗
通過非接觸式注液和孔板清洗，避免交叉污染。
2. 支持多種微孔板尺寸
能夠溫和地從任何SBS格式的96、384、1536孔板中去除液體。
3. 低殘余量
殘留體積小于0.1µl，高效洗滌效率減少了所需的洗滌循環(huán)次數(shù)。
4. DNA純化
由于采用了磁性板載體，NGS文庫的制備速度更快。
5. 快速、自動化
自動化和獨立的操作使其可以在1分鐘內(nèi)在96或384孔板中完成1次洗滌循環(huán)。
C. WASH不僅可以應用于基于磁珠的DNA純化，其創(chuàng)新的清洗方式，還可以在其他領域發(fā)揮出重要作用：
1. 細胞實驗
C.WASH自動化完成典型篩選工作流程中的所有清洗和分配步驟，已成為HTS環(huán)境中藥物發(fā)現(xiàn)或基因編輯的重要設備。
2. 免疫測定
ELISA是非常敏感的免疫測定，因此交叉污染和/或移液不準確可能導致高變異系數(shù)（CV）。C.WASH精確的非接觸式分液避免了交叉污染，因此降低了CV。此外，洗滌后的較低殘留體積可提高洗滌效率，并減少所需的洗滌次數(shù)。
3. 懸浮細胞
可以使用C.WASH作為一種簡單且可重復的方法來清洗懸浮細胞。在將平板離心獲得細胞沉淀后，使用C.WASH排空液體上清液，與手動工作流程相比，洗滌液的殘余體積持續(xù)較低，細胞回收率更大。
4. 平板圖層
用蛋白質(zhì)或多肽包被的孔板可以提高細胞對微孔板的吸附能力。使用C.WASH向孔板內(nèi)注入涂層溶液，選擇培養(yǎng)時間，清洗和干燥板，以獲得合適的涂層，可以簡化實驗室中的涂層過程。
C.WASH是一種非接觸式微孔板樣品處理系統(tǒng)，其反向離心技術可以快速且可重復地去除96、384和1536孔板上殘留量非常低的液體，此時特制的磁吸支架將磁珠吸附在孔底，以達到清洗和收集磁珠的目的。同時非接觸式注液技術能夠快速均勻地添加乙醇等試劑，避免了孔間的交叉污染。
圖1. C.WASH非接觸式微孔板樣品處理系統(tǒng)
C.WASH的這些功能有助于簡化和標準化磁珠清洗，加快NGS文庫制備工作流程，并確保在液體移除或試劑分配過程中不會發(fā)生孔間交叉污染。
一、C.WASH的評估及案例展示
案例一：使用C.WASH進行DNA自動純化樣品交叉污染的可能性
在此實驗中，我們利用哺乳動物基因組DNA中占很大比例的串聯(lián)重復序列對C.WASH進行評估，因為主要衛(wèi)星重復序列（MSRs）由234個堿基對（bp）單體的重復序列組成，這些單體在著絲粒周圍區(qū)域富集并參與異染色質(zhì)的形成。它們在基因組中的豐度以及相對較小的長度使MSR成為定量聚合酶鏈式反應（qPCR）中檢測交叉污染的理想指標。
圖2為使用C.WASH純化的工作流程：
1. 使用C.WASH移除上清液（離心力10g）
2. 使用C.WASH加入70%乙醇（20µL），等待30s
3. 使用C.WASH移除70%乙醇（離心力10g）
4. 使用C.WASH重復乙醇洗滌（步驟2和3）
5. 在室溫下放置樣品2min
6. 使用C.WASH加入20µL 超純水，孵育2min以重新水合
圖2.C.WASH在384孔板中自動DNA純化工作流程
圖3. C.WASH DNA純化工作流程沒有交叉污染
圖3. C.WASH DNA純化工作流程沒有交叉污染
A） 384孔板中純化方案的布局。前兩列是磁珠和細胞裂解物的混合物（+DNA）或磁珠和水的混合物（-DNA）。B） qPCR擴增后獲得的每個孔的循環(huán)閾值。C） 表示在擴增周期內(nèi)每個樣本的Rn值（normalized reporter value）擴增曲線。
實驗結果
- C.WASH可防止微孔板上樣本間的交叉污染(圖3）。
- C.WASH兼容高通量384孔磁珠的清理。
- 與傳統(tǒng)的手動方法相比，C.WASH減少了磁珠的清理時間和成本。
案例二：scRNA-seq文庫制備中的DNA純化
將HEK293FT(人類)和NIH3T3(小鼠)細胞經(jīng)FACS分選后，交替鋪到384孔板上，中間一行(H)作為陰性對照，如圖4所示。經(jīng)Smart-seq3儀器合成和擴增cDNA后，分別使用C.WASH和另外一種液體處理儀器BRAVO對磁珠進行清洗，并對比清洗效果。
表1. BRAVO和C.WASH的磁珠清洗流程對比圖4. C.WASH和BRAVO實現(xiàn)文庫的可視化
圖5. 使用C.WASH和BRAVO清洗后相應基因組的讀取數(shù)
實驗結果
- C.WASH整個清洗過程只需要2分鐘的時間，相比BRAVO，C.WASH能更進一步加快NGS文庫制備工作流程（表1）。
- C.WASH提供獨立的操作程序，可以與自動化的高通量工作流程無縫集成，提高每天需要處理的樣品和微孔板的數(shù)量（圖4）。
- 使用C.WASH所得到的結果顯示，它能夠避免交叉污染，從而有效地保護PCR擴增的cDNA片段（圖5）。
案例三：采用C.WASH純化PCR產(chǎn)物的DNA
SMART-seq2文庫制備后，分別對未純化的cDNA進行手工清洗和使用C.WASH清洗，然后通過生物分析儀檢測對比結果。
圖6. 手工清洗和C.WASH清洗DNA純化中的磁珠工作流程示意圖
圖7. 手工清洗和C.WASH清洗結果對比圖
實驗結果
- 手工清洗非常耗時，C.WASH將關鍵的步驟減少到僅5min，比傳統(tǒng)手動操作快5倍，同時不需要消耗槍頭（圖6）。
- 通過對比生物分析儀的結果，可以看到C.WASH與手工清洗相比，在DNA純化方面達到了相同的清洗效果，并且C.WASH清洗速度更快（圖7）。
- 非接觸式的分液方式，不僅節(jié)省了時間，還節(jié)省了槍頭，降低了實驗成本。
二、C.WASH系統(tǒng)優(yōu)勢
1. 非接觸式清洗
通過非接觸式注液和孔板清洗，避免交叉污染。
2. 支持多種微孔板尺寸
能夠溫和地從任何SBS格式的96、384、1536孔板中去除液體。
3. 低殘余量
殘留體積小于0.1µl，高效洗滌效率減少了所需的洗滌循環(huán)次數(shù)。
4. DNA純化
由于采用了磁性板載體，NGS文庫的制備速度更快。
5. 快速、自動化
自動化和獨立的操作使其可以在1分鐘內(nèi)在96或384孔板中完成1次洗滌循環(huán)。
三、C.WASH其他應用領域
C. WASH不僅可以應用于基于磁珠的DNA純化，其創(chuàng)新的清洗方式，還可以在其他領域發(fā)揮出重要作用：
1. 細胞實驗
C.WASH自動化完成典型篩選工作流程中的所有清洗和分配步驟，已成為HTS環(huán)境中藥物發(fā)現(xiàn)或基因編輯的重要設備。
2. 免疫測定
ELISA是非常敏感的免疫測定，因此交叉污染和/或移液不準確可能導致高變異系數(shù)（CV）。C.WASH精確的非接觸式分液避免了交叉污染，因此降低了CV。此外，洗滌后的較低殘留體積可提高洗滌效率，并減少所需的洗滌次數(shù)。
3. 懸浮細胞
可以使用C.WASH作為一種簡單且可重復的方法來清洗懸浮細胞。在將平板離心獲得細胞沉淀后，使用C.WASH排空液體上清液，與手動工作流程相比，洗滌液的殘余體積持續(xù)較低，細胞回收率更大。
4. 平板圖層
用蛋白質(zhì)或多肽包被的孔板可以提高細胞對微孔板的吸附能力。使用C.WASH向孔板內(nèi)注入涂層溶液，選擇培養(yǎng)時間，清洗和干燥板，以獲得合適的涂層，可以簡化實驗室中的涂層過程。
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