一步脫蠟法在FFPE樣本DNA提取中的應(yīng)用優(yōu)勢

    福爾馬林固定石蠟包埋技術(shù)（Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded, FFPE）是一種組織保存技術(shù)。這種技術(shù)為了維持細(xì)胞核蛋白結(jié)構(gòu)，先用福爾馬林固定然后將組織用固體石蠟包埋，以供切片后作組織學(xué)診斷或研究使用。

     福爾馬林由于可以與蛋白氨基發(fā)生不可逆交聯(lián)，所以對保持組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性、抗原可測定性、組織滲透性方面均優(yōu)于其他固定液。因此，F(xiàn)FPE技術(shù)長期以來在臨床檢驗(yàn)、醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用，尤其是細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究和腫瘤病理學(xué)研究。隨著這幾年分子診斷領(lǐng)域的不斷發(fā)展，F(xiàn)FPE技術(shù)也越來越多的被應(yīng)用在對腫瘤疾病進(jìn)行分子診斷。

    如果要對FFPE組織進(jìn)行分子生物學(xué)研究，最首先的就是要進(jìn)行DNA的提取。 但是固定劑的交聯(lián)作用對核酸是有害的，福爾馬林石蠟和交聯(lián)作用會妨礙核酸的提取，抑制DNA聚合酶的活性從而影響PCR擴(kuò)增。除此之外，石蠟阻礙消化液對組織的滲透，從而抑制蛋白酶K和組織內(nèi)蛋白的接觸，影響組織消化和DNA釋放。所以為了消除石蠟對DNA提取和PCR擴(kuò)增的不良影響，必須在保證不增加外源性PCR抑制因子，并盡量減少DNA額外損傷的前提下對組織進(jìn)行徹底脫蠟。

    目前應(yīng)用在成熟試劑盒中的脫蠟方法主要是有機(jī)溶劑脫蠟法，其中二甲苯脫蠟法由于其脫蠟徹底的特性，被最廣泛的應(yīng)用在腫瘤研究中。

    在二甲苯脫蠟法中，需要將石蠟包埋組織浸泡在二甲苯溶液中進(jìn)行脫蠟，后面經(jīng)過兩次高溫處理，每次各一個(gè)小時(shí)，分別在56℃和90℃。在此期間結(jié)合消化緩沖液和蛋白酶K來消化組織，同時(shí)利用梯度乙醇來疏松組織結(jié)構(gòu)、促進(jìn)消化液滲入并去除組織中痕量的二甲苯和甲醛。

    雖然二甲苯脫蠟法是目前最主流的脫蠟方法，并且被應(yīng)用在絕大多數(shù)商業(yè)試劑盒中，但是它還是有一定的問題：首先，二甲苯是一種有毒的有機(jī)試劑，在實(shí)驗(yàn)過程中如果身體接觸到會有一定程度的危害，所以此實(shí)驗(yàn)是有一定風(fēng)險(xiǎn)的；其次，此脫蠟法的實(shí)驗(yàn)過程很繁瑣，脫蠟的步驟耗時(shí)至少是耗時(shí)3小時(shí)以上，加上提取的步驟整個(gè)實(shí)驗(yàn)4小時(shí)左右，而且涉及到的試劑種類較多，容易出錯(cuò)。所以各個(gè)公司都在積極研發(fā)更高效、安全、簡易的解決方案來取代二甲苯脫蠟。

    為了簡化石蠟包埋組織的脫蠟過程，一種新的一步脫蠟法被研發(fā)出來。具體步驟如下圖所示，將新型的一步法石蠟裂解液（無毒性）與組織裂解液加入到離心管中并與切片好的石蠟組織樣本混合，在60℃和90℃各孵育1小時(shí)后管內(nèi)的液體會分成油層和水層兩層從而完成脫蠟，脫蠟后核酸會存在與水層中。

 

   相較于傳統(tǒng)的二甲苯脫蠟法，這種新的一步法脫蠟法的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在下面幾個(gè)方面：

 

   在DNA的提取效果上，下面的實(shí)驗(yàn)對比了傳統(tǒng)脫蠟法和一步脫蠟法對于大型、中型、和小型樣本的提取得率。

 

  大型樣本：切片后面積介于2.5-4 mm²、厚度介于5-20 um、體積介于0.0125-0.08 mm³之間的樣本。

  中型樣本：切片后面積介于1.5-2.5 mm²、厚度介于5-20 um、體積介于0.0075-0.05 mm³之間的樣本。

  小型樣本：切片后面積介于0.2-1.5 mm²、厚度介于5-20 um、體積介于0.001-0.03 mm³之間的樣本。

 

    結(jié)果表明，在大量樣本時(shí)，兩種方法提取得率相當(dāng)；中量和小量樣本時(shí)，一步脫蠟法的得率均大于傳統(tǒng)脫蠟法。所以一步脫蠟法不僅簡化了操作、降低了風(fēng)險(xiǎn)，而且提高了提取效率。

    在上述的優(yōu)勢中，一步脫蠟法相對于傳統(tǒng)二甲苯脫蠟法決定性的優(yōu)勢就是對于自動化的兼容性，一步法的特性使其可以非常簡單的整合到磁珠法自動化核酸提取儀上，再一次減少需要人工參與的步驟。只需要將切片好的樣本放入預(yù)裝好的試劑槽中、準(zhǔn)備好需要的耗材，開機(jī)運(yùn)行后等待即可，解放了實(shí)驗(yàn)人員時(shí)間，大大提高了實(shí)驗(yàn)效率。

  現(xiàn)在，TIANGEN公司利用此方法研發(fā)了一款石蠟組織一步法DNA提取試劑盒，配合TGuide M16/48 磁珠法自動核酸提取儀可以在3小時(shí)內(nèi)完成石蠟切片組織樣本的脫蠟、DNA提取及純化，詳情請見：

 

 

參考文獻(xiàn)：

[1] 譚卓毅，丁梅，王保捷. 福爾馬林固定石蠟包埋組織中DNA提取. 法醫(yī)學(xué)雜志, 2006(6):455-458