植物組織類樣本DNA提取完整解操作方法

植物組織類樣本DNA提取完整解決方案

​植物DNA的提取和純化是植物基因工程研究的基礎(chǔ)操作。實(shí)施分子標(biāo)記、基因圖譜、基因指紋圖譜、基因文庫構(gòu)建、遺傳多態(tài)性分析、DNA重組、RAPD（隨機(jī)引物多態(tài)性DNA）、RFLP（限制性酶多態(tài)性）、基因分離及遺傳轉(zhuǎn)化和鑒定等都以提取DNA為前提。

目前，對(duì)從植物組織中提取DNA方法的要求是：簡(jiǎn)便、有效、快捷以及經(jīng)濟(jì)。與動(dòng)物組織相比，植物組織含有較多的多糖和其他次生代謝產(chǎn)物（酚、酯、萜、色素等），這給高質(zhì)量的DNA提取帶來較多的困難。尤其是多糖成分是影響DNA純度最常見的問題。如何做到既去除這些污染物又能相對(duì)保持高的產(chǎn)量，并且能簡(jiǎn)捷有效地提純，一直是植物生物技術(shù)研究者探索的問題。

01普通的植物

對(duì)于普通的植物（低酚、低酯、低糖等）如：水稻、白菜、莧菜、南瓜、黃瓜、西紅柿、上海青、菠菜、筍瓜、冬瓜、蓮藕、山藥、竹筍等；我們可以選用普通植物DNA提取試劑盒（磁珠法）試劑（貨號(hào)：K318）。

02多糖、多酚類植物

對(duì)于多糖、多酚類植物（香蕉、西瓜、蘋果、梨等果肉，紅薯、馬鈴薯等塊莖，棉花、月季、枇杷、益母草、夏枯草等人參、曼陀羅、向天果、射干、桔梗、滿山紅、金雞納霜等藥用植物）可以選用多酚植物DNA提取試劑盒（磁珠法）試劑（貨號(hào)K319），針對(duì)類似的植物我們經(jīng)過長(zhǎng)期的優(yōu)化，可以得到較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

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以葉片為例，葉片需先剪碎成小塊，以便放入1.5ml離心管。最佳樣本的長(zhǎng)度應(yīng)在1cm 以下。重量不超過250mg，推薦使用50mg，如果是植物種子粉末可以使用10mg-20mg粉末即可。

樣本數(shù)量較少的情況下：可以使用手持式（寶予德）研磨儀，將植物的組織切碎后放入1.5ml 尖底離心管中，將研磨棒的頭部碾壓植物組織，打開研磨儀的開關(guān)，直至肉眼看到植物組織研磨成碎末。

樣本數(shù)量較多的情況下：可以使用HF Extract組織研磨儀 可以同時(shí)處理2-192個(gè)樣品（需配不同適配器）。將植物的組織切碎后放入2ml的研磨管中，加入鋼珠或二氧化鋯珠8-16顆（根據(jù)試劑情況靈活選擇），按照如下方案編輯研磨程序：

對(duì)于莖部纖維化比較嚴(yán)重的組織或者根部樣本，要配合液氮處理（將植物組織用剪刀剪切<0.5cm，放入研磨管中），使用配套的冷凍研磨套件（如下圖），將研磨罐中灌入液氮冷凍植物樣品，等液氮揮發(fā)后，快速擰好研磨罐放入研磨儀。執(zhí)行程序：

提取過程：

1.打開研磨后的管子（預(yù)先6000rpm離心30sec防止管子上的碎片或碎末飛出，污染實(shí)驗(yàn)室），加入裂解液APL（需要預(yù)熱）400-600 μl，放入水浴鍋中孵育30 min-1 h。

2.孵育后，12000 rpm 離心3min，取上清100μl-200μl 上清（含淀粉多的樣品容易糊化，可以增加離心時(shí)間至5-10min）

 

96孔預(yù)分裝板

3.加入預(yù)分裝96孔板中的第1、7列，然后放入核酸提取儀中（如下圖），插好磁棒套。點(diǎn)擊運(yùn)行程序。

4.20min后，完成DNA的提取。轉(zhuǎn)移5、11列中的DNA 至1.5ml離心管中，使用超微量分光度計(jì)（Mcro-Drop ）檢測(cè)核酸濃度：

5.記錄檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)入下步擴(kuò)增或?qū)�DNA保存至-20℃。