全新MagNA Pure 96核酸系統(tǒng)-兼顧快速和高產(chǎn)的解決方案

可提供的所有試劑盒都有小容量（SV）和大容量（LV）的不同規(guī)格，可根據(jù)要處理的樣品量決定。 本文描述了2種MagNA Pure 96 DNA和病毒核酸試劑盒及其方法的特征和性能。

材料和方法
新的試劑盒及方法是用人EDTA血漿、枸櫞酸鹽血漿、血清和全血以及培養(yǎng)細(xì)胞（K562和HeLa）作為樣品材料開發(fā)和測(cè)試的。
全血不需要經(jīng)過預(yù)處理即可用于基因組DNA分離。 培養(yǎng)細(xì)胞小球在使用前要懸浮于PBS中。

在病毒核酸分離時(shí)，使用前在樣品中添加不同量的DNA病毒（巨細(xì)胞病毒、EB病毒、細(xì)小病毒B19）和RNA病毒（甲型肝炎病毒、甲型H1N1流感病毒）。然后用移液管將樣品移入MagNA Pure 96儀器上的MagNA Pure 96處理盒中。所有樣品至少以8倍復(fù)制進(jìn)行試驗(yàn)。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，純化核酸的洗脫體積被設(shè)定為50μl、100μl或200μl。在LightCycler® 480儀器上采用吸光度（OD）測(cè)定、瓊脂糖凝膠電泳和/或參數(shù)特定的定量實(shí)時(shí)PCR和RT-PCR分析對(duì)洗脫液進(jìn)行分析。采用15μl各自混合母液和5μl各自洗脫液建立擴(kuò)增反應(yīng)，運(yùn)行45個(gè)循環(huán)。

結(jié)果和討論
一般特征
試劑盒的組成：排列在試劑盤中的預(yù)裝式試劑容器，便于加載；分開放置、含磁珠（MGP）懸液的瓶子（圖1）。試劑盤和瓶子都在運(yùn)行前放入儀器抽屜中各自的位置。使用后容器可以方便地重新密封，并保存以待必要時(shí)進(jìn)行后續(xù)的運(yùn)行。MGP瓶具有特殊的瓶蓋，可以在儀器的針穿過后自動(dòng)重新密封。所有組件在室溫下都能保持穩(wěn)定。

MagNA Pure 96 DNA和病毒核酸小容量規(guī)格用于從200μl全血，或從5×105個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞中分離基因組DNA。 它還可以從200μl血漿、血清或全血中分離病毒DNA或RNA。試劑盒包括3個(gè)預(yù)裝式試劑容器，每個(gè)容器最多可進(jìn)行192次反應(yīng)（即每個(gè)試劑盒進(jìn)行576次純化）。

MagNA Pure 96 DNA和病毒核酸試劑盒大容量規(guī)格用于從500μl或1000μl全血或從106個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞中分離基因組DNA。 它能從500μl血漿、血清或全血，
或從1000μl血漿或血清中分離病毒DNA或RNA。試劑盒包括3個(gè)預(yù)裝式試劑        圖1：試劑盒組件。
容器， 每個(gè)容器最多可進(jìn)行96次反應(yīng)（500μl）或48次反應(yīng)（1000μl）
（即每個(gè)試劑盒分別進(jìn)行288或144次純化）。  

如果需要的話，試劑盒可用于不同的優(yōu)化方法，包括外部溶解方法可供選用，從而允許在MagNA Pure 96儀器外進(jìn)行病毒滅活。對(duì)于所有方法，核酸從不同容量的樣品中都可以方便地洗脫，樣品的不同容量可以由用戶選擇。

基因組DNA
基因組DNA的分離及其后續(xù)分析顯示可重復(fù)性、產(chǎn)量、完整度和純度都很高。根據(jù)瓊脂糖凝膠分析，DNA片段平均顯著大于20 kb（圖2）。

圖2： 對(duì)血液中分離的DNA的瓊脂糖凝膠（顯示20個(gè)復(fù)本）。 在21 kb位置的DNA帶顯示了分離DNA的高完整度。 （M=分子量標(biāo)記III）

     
表1總結(jié)了典型的DNA產(chǎn)率和純度。請(qǐng)注意產(chǎn)率顯著依賴于血細(xì)胞數(shù)，因此變化可能達(dá)到2倍。 

表1：典型的DNA產(chǎn)量和純度
樣品類型	樣品量	DNA產(chǎn)量 （μg）	DNA純度 （OD260/280）	試劑盒類型
血 血 培養(yǎng)細(xì)胞 培養(yǎng)細(xì)胞	200 μl 500 μl 5 x 105 1 x 106	6.6 μg 16.5 μg 10.4 μg 22.0 μg	1.9 2.0 2.0 2.0	SV LV SV LV

如LightCycler® 480儀器中進(jìn)行的PCR之前的稀釋實(shí)驗(yàn)所示（數(shù)據(jù)未顯示），DNA也被證明不含PCR抑制劑。用不同量的血液與樣品檢測(cè)了該程序的可量測(cè)性。結(jié)果見圖3。
                                





圖3： 可量測(cè)性。 從不同量血液中分離的DNA的瓊脂糖凝膠分析顯示純化法的可量測(cè)性良好。

病毒核酸
線性范圍
達(dá)到了純化病毒DNA和RNA的高產(chǎn)率。從較寬的濃度范圍分離病毒核酸是可能的（圖4）。





圖4： 線性范圍。 每份樣品中加樣濃度為10-10⁶拷貝的Epstein-Barr病毒（EBV）DNA和甲型肝炎病毒RNA的分離。

內(nèi)部質(zhì)控和可重復(fù)性
MagNA Pure 96系統(tǒng)能在每次分離反應(yīng)中都包括一次內(nèi)部質(zhì)控（IC）。 IC從機(jī)載IC管中自動(dòng)移入每個(gè)孔中的溶解緩沖液中。在一次純化操作的所有96個(gè)孔中，采用稀釋的細(xì)小病毒B19質(zhì)粒作為IC，陰性血清作為樣品材料來檢查該功能。 IC的分離具有很高的可重復(fù)性（圖5）。

圖5： 內(nèi)部質(zhì)控品。從所處理樣品盒的所
有96個(gè)孔中分離出的細(xì)小病毒B19內(nèi)部質(zhì)
控品的PCR分析。

交叉污染試驗(yàn)
進(jìn)行這些試驗(yàn)是為了考查MagNA Pure 96儀器上可能孔間污染的程度。 細(xì)小病毒B19被選作這些試驗(yàn)的敏感參數(shù)；檢測(cè)極限大約為每次PCR 2.5個(gè)拷貝。 然后以5×107拷貝/ml（=檢測(cè)極限以上106倍）向血漿加樣，用大容量方法（500μl樣品）和50μl洗脫體積在MagNA Pure 96儀器處理。

進(jìn)行3次“棋盤式”運(yùn)行（每次有48份陽性加樣血漿樣品和48份陰性未加樣血漿樣品排列成棋盤狀）。 在LightCycler® 480儀器上對(duì)洗脫液進(jìn)行分析。 在這些條件下未發(fā)現(xiàn)交叉污染（圖6）。
 

圖6： 交叉污染試驗(yàn)。48份陽性和48份陰性樣品排列成棋盤狀，經(jīng)過處理，進(jìn)行交叉污染分析。所有陰性樣品鑒定結(jié)果均為“陰性”，而所有陽性樣品和所有質(zhì)控品都顯示了預(yù)期的信號(hào)。 該試驗(yàn)重復(fù)了3次，均得到相同的結(jié)果。

“血漿用”和“通用”方法
在方法優(yōu)化期間發(fā)現(xiàn)，有些樣品材料（即：血清、全血和枸櫞酸鹽血漿）在與“標(biāo)準(zhǔn)”材料EDTA血漿不同的工作流程下能得到更好的結(jié)果。因此，在“血漿用操作方法”之外，還提供另一種“通用操作方法”，后者能使這些樣品類型得到更好的結(jié)果（達(dá)到5個(gè)交叉閾值）。 選用“通用操作方法”這個(gè)名稱是因?yàn)檫@些方法對(duì)于血清、全血和枸櫞酸鹽血漿，優(yōu)于“血漿用操作方法”；而對(duì)于EDTA血漿，至少對(duì)所檢測(cè)的病毒（甲型肝炎病毒、甲型H1N1流感、EB病毒、巨細(xì)胞病毒）是與“血漿用操作方法”相等的。 由于結(jié)果可能隨個(gè)別實(shí)驗(yàn)設(shè)備和所檢測(cè)參數(shù)的不同而變化，因此在儀器的方法菜單中提供不同的方法供選擇，使用戶能選擇對(duì)實(shí)際應(yīng)用的最佳解決方案。

結(jié)論
新的MagNA Pure 96 DNA和病毒核酸試劑盒能從多種樣品材料中全自動(dòng)高效分離DNA和病毒核酸，具有高速和高產(chǎn)率。用戶可以根據(jù)特殊需要在幾個(gè)不同方法間作出選擇。此外，該試劑盒所能用處理的樣品容量范圍也很大。因此，對(duì)于檢測(cè)工作量大的實(shí)驗(yàn)室來說，新的試劑盒將成為有用的工具。