細(xì)胞高通量、高內(nèi)涵檢測(cè)

服務(wù)流程 
 
  
 

服務(wù)說明

 
  
  
 

高內(nèi)涵篩選的優(yōu)勢(shì)

為了快速的尋找藥物靶標(biāo)或功能基因，高通量篩選成為研究的重要工具。高通量篩選模型主要建立在分子水平之上，針對(duì)單一藥物靶點(diǎn)對(duì)被篩樣品的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，僅能夠得到有限的活性數(shù)據(jù)，無法全面反映出被篩樣品的生物活性特征，因此初篩得到的陽性結(jié)果仍需要進(jìn)一步確認(rèn)。
高內(nèi)涵篩選選則能夠在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整性的前提下，同時(shí)檢測(cè)被篩樣品對(duì)細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號(hào)傳導(dǎo)等方面的影響，在單一實(shí)驗(yàn)中獲取大量與基因、蛋白質(zhì)及其他細(xì)胞成分相關(guān)的信息，確定被篩樣品生物活性和潛在毒性的過程。高內(nèi)涵篩選應(yīng)用高分辨率的熒光數(shù)碼影像系統(tǒng)獲得被篩樣品對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的多維立體和實(shí)時(shí)快速的生物效應(yīng)信息，對(duì)其多角度分析。

 

高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)的組成

1．熒光顯微系統(tǒng)

　　許多化合物只能引起細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞器形態(tài)和分子分布等微弱的改變，因此必須使用高分辨率的熒光顯微系統(tǒng)才能夠檢測(cè)出來。細(xì)胞與熒光標(biāo)記物結(jié)合后，其生理狀態(tài)的改變即可被熒光顯微系統(tǒng)的熒光探針捕獲。

2．自動(dòng)化熒光圖像獲取系統(tǒng)

　　在觀察到熒光標(biāo)記的細(xì)胞變化后，可用高分辨率CCD相機(jī)將圖像拍攝下來。自動(dòng)化熒光圖像獲取系統(tǒng)可快速并精確地移動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板或載玻片，自由轉(zhuǎn)換各種波長(zhǎng)的激光及散射濾光片以滿足多種研究需要。若同步使用激光共聚焦技術(shù)則可以與多種細(xì)胞培養(yǎng)板匹配，在較短時(shí)間內(nèi)完成96孔板或384孔板樣品分析。另外，還可添加溫度控制系統(tǒng)以維持細(xì)胞活性，以及添加自動(dòng)加樣系統(tǒng)和白光系統(tǒng)等。

3．檢測(cè)儀器

　　觀察并獲取圖像只是高內(nèi)涵篩選技術(shù)的第一步，為了有效完成分析工作，必須利用檢測(cè)儀器從圖像中提取有價(jià)值的信息。目前，一些公司開發(fā)了應(yīng)用變化終點(diǎn)檢測(cè)和動(dòng)態(tài)活細(xì)胞檢測(cè)相結(jié)合分析方法的檢測(cè)儀器以拓展檢測(cè)范圍。代表性的是美國Cellomics公司開發(fā)出的ArrayScan HCS Reader和KineticScanTMHCS Reader等。

4．圖像處理分析軟件

　　隨著高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)的升級(jí)，需要一種新型的高內(nèi)涵篩選軟件簡(jiǎn)化和自動(dòng)化其操作,從而更加準(zhǔn)確地測(cè)定基于形態(tài)學(xué)和熒光標(biāo)記的細(xì)胞特征參數(shù)。例如Cellomics公司開發(fā)的BioApplication軟件可將多種來源的圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為生物學(xué)信息，包括來自熒光檢測(cè)、激光共聚焦、掃描流式細(xì)胞檢測(cè)及其他高內(nèi)涵篩選檢測(cè)儀器的圖像數(shù)據(jù)。

5．結(jié)果分析和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)

　　上述應(yīng)用軟件可用于追蹤分析多種細(xì)胞變化過程，如信號(hào)分子轉(zhuǎn)位、受體內(nèi)源化、鈣離子化、酶活化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期以及神經(jīng)突觸生長(zhǎng)等，通過分析個(gè)體和群體細(xì)胞水平的多種特征獲取有意義的生物信息。數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)用來儲(chǔ)存和管理已獲取的圖像和定量分析結(jié)果，并能夠?qū)⑦@些結(jié)果以圖像、表格等多種形式在個(gè)體和群體細(xì)胞水平輸出，使研究人員能夠系統(tǒng)地進(jìn)行總結(jié)并作出決策。 
 

高內(nèi)涵篩選的應(yīng)用實(shí)例

1．細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)

細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)特性影響細(xì)胞的很多生理和病理學(xué)過程，如癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、炎癥、血管形成、創(chuàng)傷修復(fù)和胚胎發(fā)育等。高內(nèi)涵篩選能夠通過測(cè)定遷移細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)軌跡分析細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。實(shí)驗(yàn)在鋪滿標(biāo)記熒光珠子的毯狀結(jié)構(gòu)上進(jìn)行，隨著細(xì)胞移動(dòng)，珠子不斷被吞噬而記錄下其運(yùn)動(dòng)軌跡，軌跡面積與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力大小是成比例的。
吉?jiǎng)P實(shí)驗(yàn)實(shí)例： 
針對(duì)不同基因的靶點(diǎn)病毒和對(duì)照病毒（877）分別感染細(xì)胞，四天后將準(zhǔn)備好的細(xì)胞種植于事先鋪滿單層fluorescent beads的特殊處理過的96孔板上，培養(yǎng)24h后，進(jìn)行固定、染色，對(duì)單個(gè)細(xì)胞標(biāo)記后，用cellomics進(jìn)行高通量掃描，通過統(tǒng)計(jì)Full-Track-Area、Motion-Track-Area、FullTrackAreaPerCell 、MotionTrackAreaPerCell等參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)篩選。分析細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的改變。
  

 

2．細(xì)胞周期檢測(cè)

PI ,即碘化丙錠,可以與細(xì)胞內(nèi)DNA 結(jié)合后能被激發(fā)產(chǎn)生熒光,通過cellomics arrayscan檢測(cè)到的與DNA 結(jié)合的PI 的熒光強(qiáng)度可以反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量的多少。由于細(xì)胞周期各時(shí)相的DNA 含量不同,通常正常細(xì)胞的G1/ G0 期具有二倍體細(xì)胞的DNA 含量(2N) ,G2/ M 期具有四倍體細(xì)胞的DNA 含量(4N) ,而S 期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。因此,通過cellomics arrayscan拍照，利用圖像分析軟件可以將細(xì)胞周期各時(shí)相區(qū)分為G1/ G0 期,S 期和G2/ M 期,并可通過軟件計(jì)算各時(shí)相的百分率。
吉?jiǎng)P應(yīng)用實(shí)例： 
分別將陰性對(duì)照靶點(diǎn)和多個(gè)目的基因有效靶點(diǎn)慢病毒感染腫瘤細(xì)胞，通過cellomics儀器對(duì)細(xì)胞進(jìn)行掃描分析，得到的周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
  
 

3．細(xì)胞增殖檢測(cè)

利用轉(zhuǎn)染、感染、染色等方法將熒光標(biāo)志物（如GFP、Hochest等）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，利用Cellomics儀器冷陰極放電(CCD) 鏡頭對(duì)細(xì)胞拍照得到高分辨的圖像,獲得帶熒光的細(xì)胞多方位信息，通過軟件分析處理計(jì)算出孔板中不同組別含有的細(xì)胞數(shù)目。基于cellomics儀器的細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)具高效、準(zhǔn)確、快速等特點(diǎn)。
吉?jiǎng)P實(shí)驗(yàn)實(shí)例： 
將針對(duì)不同基因的RNA干擾靶點(diǎn)的慢病毒（同時(shí)表達(dá)GFP）感染的各組細(xì)胞接種到96孔板中放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天將培養(yǎng)的細(xì)胞在cellomics儀器上掃描拍照，應(yīng)用vHCS Scan掃描軟件并調(diào)取檢測(cè)細(xì)胞計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)程序?qū)�孔板進(jìn)行掃描計(jì)數(shù)，連續(xù)檢測(cè)5天，每天在相同時(shí)間檢測(cè)一次，得到5個(gè)結(jié)果，最后對(duì)這5天數(shù)據(jù)進(jìn)行軟件分析，得到細(xì)胞個(gè)數(shù)等信息，并進(jìn)行結(jié)果分析，從而得到該細(xì)胞增殖圖。
   
 

4、血管生成能力檢測(cè)

Matrigel tube formation實(shí)驗(yàn)是經(jīng)典的研究腫瘤細(xì)胞分泌因子對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）成血管能力的影響的實(shí)驗(yàn)，通過cellomics拍照及圖像處理系統(tǒng)，可以一次性的得到血管密度，血管長(zhǎng)度，血管節(jié)點(diǎn)數(shù)目等眾多來反映成血管能力的強(qiáng)弱的數(shù)據(jù)指標(biāo)。
吉?jiǎng)P實(shí)驗(yàn)示例： 
在96孔板上均勻鋪入Matrigel，37度培養(yǎng)箱培養(yǎng)使其凝固，將HUVEC細(xì)胞用5%的FBS重懸；與不同基因敲減后，腫瘤細(xì)胞A549分泌上混合培養(yǎng)24h，染色后用cellomics進(jìn)行高通量掃描，通過對(duì)tube counts & density、tube location、tube area、tube length & width等分析，判斷促進(jìn)血管生成能力的差異。
  

 

5、腫瘤細(xì)胞克隆形成能力檢測(cè)

克隆形成實(shí)驗(yàn)是測(cè)定細(xì)胞增殖能力和獨(dú)立生存能力重要方法。通過細(xì)胞在培養(yǎng)板上的克隆形成能力來反映細(xì)胞的成瘤能力。通過cellomics array scan對(duì)形成的細(xì)胞群落進(jìn)行掃描后，獲得的數(shù)據(jù)可以分析細(xì)胞形成克隆的能力。
吉?jiǎng)P實(shí)驗(yàn)實(shí)例 
分別將陰性對(duì)照靶點(diǎn)和目的基因有效靶點(diǎn)慢病毒感染細(xì)胞，三天后將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化，在96孔板培養(yǎng)板中接種200個(gè)細(xì)胞/孔，繼續(xù)培養(yǎng)到對(duì)照組單個(gè)克隆中細(xì)胞數(shù)大于5天為止。用cellomics array scan儀器對(duì)孔掃描拍照，統(tǒng)計(jì)分析形成的克隆數(shù)目、克隆大小以及克隆內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。